【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测分析，具体涉及一种植物n-糖链的精准相对定量分析方法及应用。
技术介绍
1、糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰。通过多种糖基转移酶(gts)和糖基水解酶(ghs)的催化作用蛋白质与碳水化合物通过共价结合形成糖蛋白（strasser r, seifertg, doblin ms, johnson kl, ruprecht c, pfrengle f, bacic a, estevez jm.cracking the "sugar code": a snapshot of n- and o-glycosylation pathways andfunctions in plants cells. front plant sci. 2021 feb 19;12:640919. doi:10.3389/fpls.2021.640919. pmid: 33679857;）。蛋白n-糖基化是真核生物蛋白质糖基化修饰中最普遍的类型（apweiler r, hermjakob h, sharon n. on the frequency ofprotein glycosylation, as deduced from analysis of the swiss-prot database.biochim biophys acta. 1999 dec 6;1473(1):4-8. ），糖链连接在蛋白asn-x-ser/thr序列的天冬酰胺（asn）上（ser是丝氨酸，thr是
2、n-糖组学是对检测样品中所有n-糖链提取、纯化分离、检测分析以得到其结构组成和相对定量信息进行系统分析的新兴学科，以表征蛋白糖基化在生命活动过程动态变化规律（chau th, chernykh a, ugonotti j, parker bl, kawahara r, thaysen-andersenm. glycomics-assisted glycoproteomics enables deep and unbiased n-glycoproteome profiling of complex biological specimens. methods mol biol.2023;2628:235-263.）。随着技术发展，质谱高通量检测技术逐渐成为检测分析首要分析工具，所述质谱高通量检测技术是指检测时通过内标与待检测样品混合后比较质谱峰信号的相对强度，来反映样品中糖链的丰度比例，从而进行样品n-糖链的相对定量分析。所述相对定量分析是以混合在样品中的内标作为参照，反应不同待检测样品含量相对于同一个检测内标含量的倍数高低变化，以与内标不同的倍数关系反应不同样品之间的含量相对高低的定量方法，可消除因仪器检测等的误差影响，操作简便，可以反应n-糖链的含量变化情况。所述相对定量分析分为普通相对定量分析和所述精准相对定量分析，所述精准相对定量分析是指内标与样品的质量位移差＞3da，反之普通相对定量分析是指内标与样品的质量位移差≤3da。
3、在植物体n-糖链定量分析体系中，植物体中叶、根、果实和花等多种组织部位富含色素物质，植物体中色素的种类多如花青素、叶绿素、类胡萝卜素等参与植物色泽品质调控和挥发性物质形成。色素对紫外光具有吸收度且为极性较高，检测时严重影响n-糖链的相对定量分析准确性，（garcía-gómez be, salazar ja, nicolás-almansa m, razi m,rubio m, ruiz d, martínez-gómez p. molecular bases of fruit quality in prunusspecies: an integrated genomic, transcriptomic, and metabolic review with abreeding perspective. int j mol sci. 2020 dec 30;22(1):333. doi: 10.3390/ijms22010333. pmid: 33396946; pmcid: pmc7794732.），因此植物体n-糖链相对定量分析体系需要进行更加复杂的除杂纯化。同时细胞壁是植物体细胞含有特征结构，坚硬而厚实的支撑物其成分为黏质复合物，存在于细胞膜的外部，维持细胞形态能增强植物抵抗外力的机械强度，在n-糖链提取过程中，植物样品需要比动物更加严密的工序才能使样品混合均匀。因此，植物n-糖链的提取、纯化比动物体更难。在分析检测方面，目前在动物体中使用的检测分析方式是代谢标记和酶促18o标记与样品的质量位移差均≤3da，属于普通相对定量分析，存在精准性差、应用对象局限、细胞培养周期长、操作复杂的问题。目前代谢标记和酶促18o标记应用对象是动物体，所述代谢标记的应用对象是细胞样品，具体是将内标的细胞样品置于培养基中培养，在培养基中加入酰胺-15n 谷氨酰胺作为细胞培养物的唯一氮源，使其通过己糖胺途径掺入到糖链中，标记后的糖链与普通酰胺-14n 谷氨酰胺标记的糖链仅能形成1da质量位移差，需要较长的细胞培养周期且需要每天更换培养基操作复杂。(zhu y, wu j, chen x. metabolic labeling and imaging of n-linked glycans inarabidopsis thaliana. angew chem int ed engl. 2016 aug 1;55(32):9301-5. doi:10.1002/anie.201603032. epub 2016 jun 27. pmid: 27346875.) 。所述酶促18o标记产生的内标与待检测样品之间仅有2da质量位移差，与样品混合检测时易与待检测样品n-糖链本身的2～3da的同位素峰堆叠引入误差，相对定量分析的精准性很差(cao w, zhang w,huang j, jiang b, zhang l, yang p. glycan reducing end dual isotopic labeling(gredil) for mass spectrometry-based quantitative n-glycomics. chem commun(camb). 2015 sep 14;51(71):13603-6.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种植物N-糖链的精准相对定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N-糖链含量的相对定量分析的公式为：A1=Na1/Na1内标，A2=Na2/Na2内标，……An= Nan/Nan内标……；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双标签标记反应是指在所述N-糖链释放的同时先进行酶促同位素标记，在所述N-糖链释放完成后再进行氧化还原开环反应以获得5Da质量位移差的植物双标签N-糖链内标。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离的方法为将待测的植物N-糖链粗样品采用配置的Buffer Y缓冲液提取植物总蛋白，使用甲醇、丙酮除去植物总蛋白中的色素杂质，获得植物蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切的方法为采用胰蛋白酶、糜蛋白酶酶切植物蛋白得到植物多肽样品。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N-糖链释放的方法为采用PNGase A试剂对获得的植物多肽样品进行酶切释放植物N-糖链。
7.根据权利要求1所述的方法，其
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述质谱图谱包括基质辅助激光解吸附电离质谱、电喷雾质谱、串级质谱、多级质谱中的任意一种或多种。
9.一种分离纯化植物N-糖链的精准相对定量分析方法及应用在植物N-糖组学中的应用，所述应用的方法为：
10.一种如权利要求1-8任一项所述的植物N-糖链的精准相对定量分析方法在果实成熟研究中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种植物n-糖链的精准相对定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述n-糖链含量的相对定量分析的公式为：a1=na1/na1内标，a2=na2/na2内标，……an= nan/nan内标……；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双标签标记反应是指在所述n-糖链释放的同时先进行酶促同位素标记，在所述n-糖链释放完成后再进行氧化还原开环反应以获得5da质量位移差的植物双标签n-糖链内标。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离的方法为将待测的植物n-糖链粗样品采用配置的buffer y缓冲液提取植物总蛋白，使用甲醇、丙酮除去植物总蛋白中的色素杂质，获得植物蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵晓勇，王嘉祺，吴迪，李鲜，张波，徐昌杰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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