检测中华鳖细小病毒的特异性引物、探针及快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测中华鳖细小病毒的特异性引物、探针及快速检测试剂盒，其中，中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速检测试剂盒包含引物组A，中华鳖细小病毒荧光定量检测试剂盒包括特异性引物组B和Taqman荧光探针C；本发明专利技术采用链置换酶、等温扩增和荧光定量技术，通过检测中华鳖细小病毒的衣壳蛋白基因，来检测中华鳖细小病毒，这是目前国内外首次研制检测中华鳖细小病毒的引物组和试剂盒。该试剂盒的研制为中华鳖细小病毒病的监测和预防奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于靶DNA片断的快速检测领域，具体地说，涉及一种检测中华鳖细小病毒的特异性引物、探针及快速检测试剂盒。
技术介绍
中华鳖细小病毒(TrionyxsinensisDependoparvovirus，TSDPV)是引起中华鳖大量死亡的致病性病毒，常引起中华鳖肝炎、肠道卡他性炎症和胰脏点状坏死，对中华鳖养殖产业危害极大。TSDPV为单链DNA病毒，属于细小病毒目细小病毒科细小病毒亚科依赖性细小病毒属，该病毒是目前发现能够感染中华鳖的第二个DNA病毒。该病毒于2012年从患肝炎和肠炎的中华鳖中分离获得，其造成中华鳖在养殖期大量死亡，死亡率一般为60～70％，严重的达到85％以上，近几年造成的经济损失无法估量。该病毒在国内外未见报道，由于该病毒至今未有检测试剂盒和检测方法，严重阻碍了该病毒引起疾病的预防工作，因此该病毒检测试剂盒的开发和检测技术的研究显得尤为重要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述问题，提供了一种检测中华鳖细小病毒的特异性引物、探针及快速检测试剂盒，本专利技术的引物、探针和试剂盒特异性强，敏感性高，能实现快速、有效且准确检测中华鳖细小病毒；本专利技术中的两种试剂盒分别为链置换等温扩增可视化快速检测试剂盒和荧光定量检测试剂盒，两种试剂盒都是在封闭的情况下判断结果，扩增产物不会对检测环境造成污染，可用于中华鳖细小病毒病的监测和早期预防。本专利技术采用链置换酶、等温扩增和荧光定量技术，通过检测中华鳖细小病毒的衣壳蛋白基因，来检测中华鳖细小病毒，这是目前国内外首次研制检测中华鳖细小病毒的试剂盒；该试剂盒的研制为中华鳖细小病毒病的监测和预防奠定基础。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种检测中华鳖细小病毒的特异性引物组A，该引物组A包含引物TSDPV-F3、引物TSDPV-B3、引物TSDPV-FIP和引物TSDPV-BIP，引物TSDPV-F3的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；引物TSDPV-B3的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；引物TSDPV-FIP的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；引物TSDPV-BIP的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。本专利技术还公开了一种检测中华鳖细小病毒的引物探针混合物，其由引物组B和Taqman荧光探针C组成，探针C的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。进一步地，引物组B包含引物TSDPV-q165F和引物TSDPV-q165R；引物TSDPV-q165F的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；引物TSDPV-q165R的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；探针的C的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示。进一步地，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁3.5、花菁5和花菁5.5中的一种或几种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的一种或几种。本专利技术还公开了一种中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速检测试剂盒，包括病毒DNA提取试剂和反应试剂。病毒DNA提取试剂包含以下组分：成分为100mMTris、50mMEDTA、500mMNaCl、2％SDS、10mMβ-巯基乙醇的pH8.0的裂解液A；乙酸钾水溶液，浓度5M；无水乙醇；DEPC水配置的含75％无水乙醇的洗液A；DEPC水。反应试剂包括以下组分：1)预反应液：20mMpH为8.8的Tris-HC1、8mM硫酸镁、14mM氯化钾、10mM硫酸按、0.l2％Tween-20、1.4mMdNTP、0.6M甜菜碱、0.15～0.25μM引物TSDPV-F3、0.15～0.25μM引物TSDPV-B3、1.6～2.0μM引物TSDPV-FIP和1.6～2.0μM引物TSDPV-BIP；2)反应酶：每微升含8个活性单位的BstDNA聚合酶；3)反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成；4)反应显色液：含有10％SYBRGreenI的荧光染料。本专利技术还公开了一种上述中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速检测试剂盒在检测中华鳖细小病毒基因中的应用，包括以下步骤：1)DNA抽提：取中华鳖肝脏或脾脏组织30-80mg于1.5mL离心管中，采用病毒DNA提取试剂进行DNA提取；2)中华鳖细小病毒基因扩增：①根据待检测样品的数目，设置所需反应管数N，N＝样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；②吸取所述的预反应液的体积为N×23μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NμL反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；③向设定的N个反应管中分别加入24uL步骤②得到的混合液，得到N个PCR反应管，向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各luL；④在上述步骤③得到的反应管中再分别加入30uL反应封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；⑤在63℃下恒温反应60分钟；3)显色检测：取出经步骤2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入luL反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，绿色判断为阳性，浅黄色为阴性，观察结束后将反应管装入密封袋，丢弃至特定区域。本专利技术还公开了一种中华鳖细小病毒荧光定量检测试剂盒，包括特异性引物组B和Taqman荧光探针C。进一步地，Taqman荧光探针C核苷酸序列5’端标记6-FAM，3’端标记BHQ1。进一步地，该试剂盒还包括独立包装的病毒裂解液、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品，其中病毒裂解液为含有10mMTris、1.0mMEDTA，pH8.0的缓冲液，PCR反应液为探针法荧光定量PCR反应液，阴性质控品为灭菌生理盐水，阳性质控品是含有中华鳖细小病毒衣壳蛋白基因的载体。本专利技术还公开了一种由上述检测中华鳖细小病毒荧光定量检测试剂盒在检测中华鳖细小病毒中的应用，包括以下步骤：待检样品使用病毒裂解液采用煮沸裂解法提取DNA，分别加入到引物探针混合液，再加入PCR反应液，混匀后进行荧光定量PCR，反应条件为95℃条件下反应5-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测中华鳖细小病毒的特异性引物组A，其特征在于，该引物组A包含引物TSDPV‑F3、引物TSDPV‑B3、引物TSDPV‑FIP和引物TSDPV‑BIP，所述的引物TSDPV‑F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的引物TSDPV‑B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述的引物TSDPV‑FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述的引物TSDPV‑BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
1.检测中华鳖细小病毒的特异性引物组A，其特征在于，该引物组A
包含引物TSDPV-F3、引物TSDPV-B3、引物TSDPV-FIP和引物TSDPV-BIP，
所述的引物TSDPV-F3的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
所述的引物TSDPV-B3的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
所述的引物TSDPV-FIP的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；
所述的引物TSDPV-BIP的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。
2.检测中华鳖细小病毒的引物探针混合物，其特征在于，其由引物组
B和Taqman荧光探针C组成，Taqman荧光探针C的5’端标记有荧光报
告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的引物探针混合物，其特征在于，所述引物组
B包含引物TSDPV-q165F和引物TSDPV-q165R；
所述的引物TSDPV-q165F的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；
所述的引物TSDPV-q165R的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；
所述Taqman荧光探针C的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示。
4.根据权利要求2所述的引物探针混合物，其特征在于，所述荧光报
告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧
基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，
5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁3.5、花菁
5和花菁5.5中的一种或几种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、
4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭
剂3中的一种或几种。
5.一种中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速检测试剂盒，其特
征在于，包括病毒DNA提取试剂和反应试剂。
6.根据权利要求5所述的中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速
检测试剂盒，其特征在于，所述的病毒DNA提取试剂包含以下组分：成分
为100mMTris、50mMEDTA、500mMNaCl、2％SDS、10mMβ-巯基乙

\t醇的pH8.0的裂解液A；乙酸钾水溶液，浓度5M；无水乙醇；DEPC水配
置的含75％无水乙醇的洗液A；DEPC水。
7.根据权利要求5所述的中华鳖细小病毒链置换等温扩增可视化快速
检测试剂盒，其特征在于，所述的反应试剂包括以下组分：
1)预反应液：20mMpH为8.8的Tris-HC1、8mM硫酸镁、14mM氯
化钾、10mM硫酸按、0.l2％Tween-20、1.4mMdNTP、0.6M甜菜碱、0.15～
0.25μM引物TSDPV-F3、0.15～0.25μM引物TSDPV-B3、1.6～2.0μM引
物TSDPV-FIP和1.6～2.0μM引物TSDPV-BIP；
2)反应酶：每微升含8个活性单位的BstDNA聚合酶；
3)反应封闭液：由矿物油或液体石...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘晓艺，袁雪梅，沈锦玉，蔺凌云，姚嘉赟，徐洋，尹文林，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33