一种同时检测柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的多重RT-PCR方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种同时检测柑橘黄化脉明病毒和柑橘衰退病毒2种柑橘病毒的多重RT‑PCR方法。该方法选用CYCVC和CTV 2种病原外壳蛋白保守序列及内参基因的特异性引物，对影响多重PCR的Mg

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物病理领域，具体涉及同时检测柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的多重RT-PCR方法及其应用。
技术介绍
柑橘黄化脉明病毒(Citrusyellowveinclearingvirus，CYVCV)引起的柑橘黄脉病是我国新发生的一种病害，对柑橘产业尤其是柠檬产业构成严重威胁。CYVCV是由7529个核苷酸组成的正义单链RNA(+ssRNA)病毒，属于柑橘病毒属(Mandarivirus)的成员。CYVCV除了通过嫁接、摩擦接种传播以外，在菜豆(Phaseolusvulgaris)和豇豆(Vignaunguiculata)上还可通过绣线菊蚜(AphisspiraecolaPatch)和豆蚜(A.CraccivoraKoch)进行传播。由柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)引起的柑橘衰退病，是世界性的柑橘病毒病害，对全世界的柑橘产业造成严重经济损失。CTV是由19226～19296个核苷酸组成的正义单链RNA病毒，属于长线形病毒属(Closterovirus)，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒。CTV除了通过嫁接传播以外，在田间还可通过蚜虫如褐色橘蚜(Toxopteracitricida)、棉蚜(Aphidgossypii)和橘二叉蚜(T.aurantii)等以非循回型半持久方式进行传播。为了快速评价田间果树和苗木CYVCV和CTV的感病情况，亟需建立同时快速检测多种病毒的多重RT-PCR检测方法对于CYVCV和CTV的检测。有关CYVCV和CTV分别检测方法已有许多报道。采用指示植物鉴定法；电子显微镜检测法；使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测，RT-PCR分子检测法等。多重RT-PCR技术具有灵敏、快速、经济等特点，广泛应用于植物病毒检测。CYVCV和CTV具有相似的传播途径，由于长期不规范的田间操作、苗木生产以及介体昆虫传播，导致这两种病毒广泛传播和流行，对柑橘产业造成严重的危害，田间常出现这两种病害混合侵染现象。而目前国内尚无CYVCV和CTV同时多重PCR检测方法的报道，因此建立一套同时检测这两种病毒的一步法多重RT-PCR检测体系，为评价这两种病毒在田间侵染情况以及在苗木脱毒过程中病毒的脱除情况，提供快速、简便、可靠的检测方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种同时检测大田CYVCV和CTV一步法多重RT-PCR方法，实现CYVCV和CTV同时、快速、灵敏检测，为提高CYVCV和CTV高效检测效率和及时有效防治赢取时间。影响多重RT-PCR反应的因素很多，专利技术人综合考虑了引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、退火温度以及循环次数等变化的影响，首先对体系中Mg2+和dNTP的用量进行调整，增加Mg2+浓度，获得最适宜的扩增效果，提高了PCR反应的扩增效率，本体系采用Mg2+浓度为0.625mmol/L和dNTP浓度为0.2～0.25mmol/L。其次，本专利技术就影响一步法多重RT-PCR扩增的三对引物浓度进行了优化调整，为排除总RNA在提取中杂质和操作过程的影响，加入了高度保守的Ubiquitin序列作为内参基因，使此多重RT-PCR检测体系结果更真实可信。但UBQ引物在柑橘中特异性或其在引物间竞争扩增能力较弱，短片段的UBQ扩增效率比另外两个病毒的扩增效率低，UBQ的扩增片段较短且与引物二聚体接近，有时会导致UBQ扩增结果不易辨别，所以要协调三对引物在整个反应体系中的平衡关系，最后确定CYVCV引物浓度为0.15～0.2μmol/L，CTV引物浓度为0.1～0.13μmol/L，Ubiquitin引物浓度为0.5μmol/L。且多重PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，不需要大型的检测仪器，常规实验操作方便，适合两种病毒在田间侵染情况的同时快速检测。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：同时检测柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的多重RT-PCR方法，提取待检叶片样品的总DNA为模板，以SEQIDNO.1～SEQIDNO.6所示序列为引物进行多重RT-PCR扩增，其扩增产物用琼脂糖凝胶电泳判定结果，多重RT-PCR扩增的特定PCR反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性4min；94℃变性30s，62℃～63℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃10min；10℃终止反应。进一步，所述的引物对为：SEQIDNO.1CYVCVF：TACCGCAGCTATCCATTTCCSEQIDNO.2CYVCVR：GCAGAAATCCCGAACCACTASEQIDNO.3LDF：TCATTGCAAAGTGACGACGACSEQIDNO.4LDR：TGCCTGACATTGGTAACTACGSEQIDNO.5UBQF：GATCTTCGCCTTAACGTTGTSEQIDNO.6UBQR：GTTGATTTTTGCTGGGAAGC多重PCR扩增总反应体系中，Mg2+浓度为0.625mmol/L，dNTPs浓度为0.2～0.25mmol/L，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2引物浓度各为0.15～0.2μmol/L，SEQIDNO.3和SEQIDNO.4引物浓度各为0.1～0.13μmol/L，SEQIDNO.5和SEQIDNO.6引物浓度为0.5μmol/L。多重RT-PCR检测方法在检测植物柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒应用，其所述的植物种类为芸香科柑橘属植物。进一步，所述的芸香科柑橘属植物为柚、甜橙、柠檬、沙柑、橘橙。本专利技术的有益效果在于：本体系能同时从4ng/μL的样品总核酸中检测出CYVCV和CTV。与单一RT-PCR相比，操作简便、节约时间和成本，避免样品间的交叉污染导致假阳性，且能达到与单一PCR的灵敏度，可以同时准确的检测柑橘中CYVCV和CTV的侵染。并加入了高度保守的Ubiquitin序列作为内参基因，使此多重RT-PCR检测体系结果更真实可信。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为不同循环次数多重RT-PCR扩增结果；图2为不同Mg2+和dNTPs用量组合多重RT-PCR扩增结果；图3为不同退火温度多重RT-PCR扩增结果；图4为CYVCV和CTV不同引物浓度多重RT-PCR扩增结果图5为内参基因不同引物浓度多重RT-PCR扩增结果；图6为2种柑橘病毒的多重RT-PCR检测结果；图7为单一RT-PCR(A、B)和多重RT-PCR(C)灵敏度比较结果；图8为多重RT-PCR对田间样品检测结果。其中，图1中A为30个循环次数扩增结果；B为35个循环次数扩增结果；M：DL2000分子量标准；1：健康甜橙；2：CYVCV+CTV混合甜橙；3：水对照；图2中M:DL2000分子量标准，1～7见表2；图3中A为不同退火温度下健康对照扩增结果；B为不同退火温度下感病样品扩增结果；M：DL2000分子量标准，1-12分别为退火温度51.0、51.3、52.1、53.4、54.8、56.3、57.7、59.1、60.6、61.9、62.7和63℃；图4中A为CTV不同引物浓度多重RT-PCR扩增结果1～3：CTV的引物浓度分别为0.1、0.13、0.15μmol/L；M：DL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的多重RT‑PCR方法，其特征在于：提取待检叶片样品的总核酸为模板，以SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示序列为引物进行多重RT‑PCR扩增，其扩增产物用琼脂糖凝胶电泳判定结果，所述多重RT‑PCR扩增的退火温度为62℃～63℃。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于：提取待检叶片样品的总核酸为模板，以SEQIDNO.1～SEQIDNO.6所示序列为引物进行多重RT-PCR扩增，其扩增产物用琼脂糖凝胶电泳判定结果，所述多重RT-PCR扩增的退火温度为62℃～63℃。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，多重RT-PCR扩增反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性4min，94℃变性30s，62℃～63℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环，72℃10min，10℃终止反应。3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：多重P...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金香，赵恒燕，周常勇，陈洪明，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50