本发明专利技术属于分子生物学及基因工程技术领域，公开了一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法。其包括以下操作步骤：将小桐子组培苗叶片切成0.5～1mm宽的叶条，置于酶解液中避光、22～25℃静置酶解6～7h，过滤洗涤原生质体，加入一定的质粒DNA、原生质体和PEG4000/Ca2+溶液处理后，培养18～40h后在激光扫描共聚焦显微镜下观察。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学及基因工程
，特别涉及。
技术介绍
小桐子(Jatropha carcas L.)，又名麻疯树，为大戟科麻风树属落叶灌木或小乔木。小桐子种子含油率高，经过加工可制成生物柴油，有着较强的市场开发潜力和应用前景。瞬时表达技术是在相对短的时间内将目标基因转入靶细胞内，获得该基因短暂的高水平表达的技术，是一种快速、方便的研究基因-蛋白质的方法。目前，关于获得小桐子原生质体的技术信息十分匮乏。因此，我们通过已有的拟南芥原生质体制备的方法，调整改进后可以获得小桐子高活性的原生质体，可以用于瞬时表达分析研究。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:，包括以下操作步骤:(I)称取1.82g甘露醇溶于20ml双蒸水中，配制甘露醇溶液装在灭菌小烧杯里；(2)在超净台上取小桐子组培苗叶片，用刀片切成0.5?Imm宽的叶条，将切好叶条放入甘露醇溶液中；(3)将叶条捞出放入预先配好的装有15ml酶解液的50ml锥形瓶中，避光，22?25°C静置酶解6?7h ;当酶解液变绿时摇晃锥形瓶，促使原生质体释放出来；(4)加入15ml等体积预冷的W5溶液，用100目的滤网进行过滤，滤液于50ml圆底离心管中置于冰上；(5)用离心力80g离心2min，去除上清，沿管壁加入5ml预冷的W5溶液，冰上放置30min，同时取20 μ I溶液用细胞计数板计数；(6)原生质体沉淀在离心管底部，去除上清，用MMg溶液将原生质体悬浮制成浓度为2 X 15个/mL的原生质体悬浮液；(7)在2ml的灭菌离心管中加入10 μ I的质粒DNA溶液；质粒DNA溶液中含有10?20 μ g 质粒 DNA ；(8)向步骤(7)所得质粒DNA溶液中加入100 μ I步骤(6)所得原生质体悬浮液；(9)再加入110 μ I PEG4000/Ca2+溶液，用剪头的枪头吸打混匀；(10) 22?25°C下避光诱导转化混合物15?30min ；(11)加入440 μ I的W5溶液稀释转化混合液，然后颠倒离心管使之混合以终止转化反应；(12)80g离心2min然后去除上清；(13)再用Iml的W5溶液重悬原生质体于六孔组织培养皿中，在W5溶液中加入50 μ 1/ml氨苄青霉素；(14)在避光和23°C条件下培养原生质体18?40h ；(15)用离心力80g离心2min，然后去上清，留下10?20 μ I的溶液，在激光扫描共聚焦显微镜下观察基因瞬时表达；所述酶解液是按照以下方法制备得到:将纤维素酶RlO (Cellulase R10)、离析酶RlO (Mecerozyme R10)、甘露醇(mannitol)、氣化钟(KCl)和pH为5.7的2-吗琳乙横酸(MES)加入到ddH20中混合后，55°C水浴加热10分钟；冷却至室温后加入氯化钙(CaCl2)、牛血清蛋白(BSA)和β -巯基乙醇(β -Mercaptoethanol)，用0.45 μ m滤膜过滤后，得到酶解液；各组分在酶解液中的浓度如下:质量分数2.0 %的纤维素酶R10、质量分数0.4 %的离析酶R10、0.4M甘露醇、20mM氯化钾、20mM 2-吗啉乙磺酸、1mM氯化钙、质量分数0.1 %的牛血清蛋白、50 μ I β -巯基乙醇；所述W5溶液是按照以下方法制备得到:将葡萄糖(glucose)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)、氯化钾(KCl)和pH为5.7的2-吗啉乙磺酸混合后，用0.45 μ m滤膜过滤后使用；各组分在W5溶液中的浓度如下:5mM葡萄糖、154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾、2mM 2-吗啉乙磺酸；所述溶液是按照以下方法制备得到:将氯化镁(MgCl2)、pH为5.7的2_吗啉乙磺酸和0.4M甘露醇混合后，用0.45 μ m滤膜过滤后使用；各组分在MMg溶液中的浓度如下:15mM氯化镁、4mM 2-吗啉乙磺酸、0.4M甘露醇；所述PEG4000/Ca2+溶液是按照以下方法制备得到:将PEG4000、甘露醇和氯化钙(CaCl2)混合后，用无菌水定容至Iml ;各组分在PEG4000/Ca2+溶液中的浓度如下:质量体积分数40% (即10ml的溶液中含有40g的PEG4000)的PEG4000、0.2M甘露醇、10mM氯化钙。步骤(13)所述六孔组织培养皿在使用之前预先用质量分数5%的BSA充分浸润。步骤(9)所述PEG4000/Ca2+溶液是在使用之前Ih配置。所述离心均是将加速(Accel)与减速(Decel)均调至O档。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果:(I)本专利技术不需要用真空栗于黑暗中抽30min，节省步骤和时间。(2)本专利技术改进了酶解液配方，使木本植物的原生质体更易游离出来。(3)本专利技术调整了 PEG4000/Ca2+溶液的配方，更有效的提高转化效率。【附图说明】图1是使用本专利技术方法提取的小桐子原生质体，得到的小桐子JcSUT4_GFP瞬时表达图；其中，GFP-Vector为空载体对照、GFP为绿色荧光、Auto-为叶绿体自发荧光、Brightfield为明场、Merged为三个通道的融合。(注:Bar = 10 μ m)。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1 (I)称取1.82g甘露醇溶于20ml双蒸水中，配制甘露醇溶液装在灭菌小烧杯里；(2)在超净台上取小桐子组培苗叶片，用刀片切成0.5?Imm宽的叶条，将切好叶条放入甘露醇溶液中；(3)将叶条捞出放入预先配好的装有15ml酶解液的50ml锥形瓶中，避光，22?25°C静置酶解6?7h ;当酶解液变绿时摇晃锥形瓶，促使原生质体释放出来；(4)加入15ml等体积预冷的W5溶液，用100目的滤网进行过滤，滤液于50ml圆底离心管中置于冰上；(5)用离心力80g离心2min，去除上清，沿管壁加入5ml预冷的W5溶液，冰上放置30min，同时取20 μ I溶液用细胞计数板计数；(6)原生质体沉淀在离心管底部，去除上清，用MMg溶液将原生质体悬浮制成浓度为2 X 15个/mL的原生质体悬浮液；(7)在2ml的灭菌离心管中加入10 μ I的质粒DNA溶液；质粒DNA溶液中含有10?20 μ g 质粒 DNA ；(8)向步骤(7)所得质粒DNA溶液中加入100 μ I步骤(6)所得原生质体悬浮液；(9)再加入110 μ I PEG4000/Ca2+溶液，用剪头的枪头吸打混匀；(10) 22?25当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)称取1.82g甘露醇溶于20ml双蒸水中，配制甘露醇溶液装在灭菌小烧杯里；(2)在超净台上取小桐子组培苗叶片，用刀片切成0.5～1mm宽的叶条，将切好叶条放入甘露醇溶液中；(3)将叶条捞出放入预先配好的装有15ml酶解液的50ml锥形瓶中，避光，22～25℃静置酶解6～7h；当酶解液变绿时摇晃锥形瓶，促使原生质体释放出来；(4)加入15ml等体积预冷的W5溶液，用100目的滤网进行过滤，滤液于50ml圆底离心管中置于冰上；(5)用离心力80g离心2min，去除上清，沿管壁加入5ml预冷的W5溶液，冰上放置30min，同时取20μl溶液用细胞计数板计数；(6)原生质体沉淀在离心管底部，去除上清，用MMg溶液将原生质体悬浮制成浓度为2х105个/mL的原生质体悬浮液；(7)在2ml的灭菌离心管中加入10μl的质粒DNA溶液；质粒DNA溶液中含有10～20μg质粒DNA；(8)向步骤(7)所得质粒DNA溶液中加入100μl步骤(6)所得原生质体悬浮液；(9)再加入110μl PEG4000/Ca2+溶液，用剪头的枪头吸打混匀；(10)22～25℃下避光诱导转化混合物15～30min；(11)加入440μl的W5溶液稀释转化混合液，然后颠倒离心管使之混合以终止转化反应；(12)80g离心2min然后去除上清；(13)再用1ml的W5溶液重悬原生质体于六孔组织培养皿中，在W5溶液中加入50μl/ml氨苄青霉素；(14)在避光和23℃条件下培养原生质体18～40h；(15)用离心力80g离心2min，然后去上清，留下10～20μl的溶液，在激光扫描共聚焦显微镜下观察基因瞬时表达；所述酶解液是按照以下方法制备得到：将纤维素酶R10、离析酶R10、甘露醇、氯化钾和pH为5.7的2‑吗啉乙磺酸加入到ddH2O中混合后，55℃水浴加热10分钟；冷却至室温后加入氯化钙、牛血清蛋白和β‑巯基乙醇，用0.45μm滤膜过滤后，得到酶解液；各组分在酶解液中的浓度如下：质量分数2.0﹪的纤维素酶R10、质量分数0.4﹪的离析酶R10、0.4M甘露醇、20mM氯化钾、20mM 2‑吗啉乙磺酸、10mM氯化钙、质量分数0.1﹪的牛血清蛋白、50μlβ‑巯基乙醇；所述W5溶液是按照以下方法制备得到：将葡萄糖、氯化钠、氯化钙、氯化钾和pH为5.7的2‑吗啉乙磺酸混合后，用0.45μm滤膜过滤后使用；各组分在W5溶液中的浓度如下：5mM葡萄糖、154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾、2mM 2‑吗啉乙磺酸；所述MMg溶液是按照以下方法制备得到：将氯化镁、pH为5.7的2‑吗啉乙磺酸和0.4M甘露醇混合后，用0.45μm滤膜过滤后使用；各组分在MMg溶液中的浓度如下：15mM氯化镁、4mM 2‑吗啉乙磺酸、0.4M甘露醇；所述PEG4000/Ca2+溶液是按照以下方法制备得到：将PEG4000、甘露醇和氯化钙混合后，用无菌水定容至1ml；各组分在PEG4000/Ca2+溶液中的浓度如下：质量体积分数40％的PEG4000、0.2M甘露醇、100mM氯化钙。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：彭昌操，杨紫薇，刘思雯，韩鸿均，刘应波，任陈希，白雪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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