一种韦兰胶合成菌原生质体制备与再生的方法技术

本发明专利技术是一种韦兰胶合成菌原生质体制备与再生的方法，属于微生物工程技术领域。本发明专利技术以韦兰胶产合成菌sphingomonas sp为出发菌株，通过酶解法制备该菌株的原生质体，所得到原生质体的形成率为97.3％，再生率为33.9％。该方法操作简便，原生质体制备率高，活性强，有利于进一步利用原生质体融合和基因组改组进行韦兰胶优良菌种的选育。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物工程领域，具体涉及韦兰胶合成菌原生质体的制备与再生方法。
技术介绍
韦兰胶是一种微生物代谢胶，是鞘氨醇胶单胞菌属菌株合成的一种多糖产物，具有优良的流变性能，且粘度对温度、酸碱度、金属盐离子相对较稳定，特别是具有良好的抗高温性能，在25～100℃范围内，韦兰胶溶液的粘度变化很小。作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、润滑剂，韦兰胶广泛应用于食品、混凝土、石油、化工等领域。但是与黄原胶等开发成熟的微生物代谢胶相比，韦兰胶的发酵生产还存在一些问题，特别是发酵产量低，发酵液中胶含量少；副产物偏多，影响产物的提取质量。原生质体融合是微生物育种的一种重要技术，可以改良菌种遗传性状、提高有用代谢产物产量，还可以综合不同菌株代谢特征，产生新的有用代谢产物。通过融合把来自于不同微生物的细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传及生物特性。原生质体的制备是原生质体融合技术前提，高效地去除微生物的细胞壁，并最大程度地保护微生物的活力，成功实现再生是整个操作的关键。在细菌的原生质体融合领域，与革兰氏阳性菌相比，革兰氏阴性菌的操作更为复杂，这主要是由于阴性菌的细胞壁更复杂，而细菌胞外分泌有多糖类产物后，掌握去壁与再生的条件将更加困难。利用原生质体融合技术，将韦兰胶合成菌制备成的原生质体与其它产量高的细菌原生质体进行融合，可以选育出具有产量更高，产物性能更优良的融合子。高效的韦兰胶合成菌原生质体制备与再生方法可以为其融合育种奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种韦兰胶合成菌的原生质体制备与再生的方法，使其原生质体制备率及再生率达到较高范围。本专利技术所采用的技术方案如下：(1)菌种活化取-70℃保藏的菌种Sphingomonassp，在无菌操作条件下将其划线到固体平板培养基上，30℃恒温培养72h，挑取单菌落在试管斜面上划线，30℃恒温培养72h。(2)菌种培养在无菌操作条件下，用5mL无菌水将试管斜面上的菌体冲洗下，转接到含有100mL液体培养基(培养基配方：酵母粉2.5g/L，麦芽浸粉0.25g/L，pH7.0±0.5)的250mL三角瓶中，30℃，150r/min摇床培养。(3)原生质体的制备菌株液体培养至适当时期，取菌液在8000r/min条件下离心5min，弃上清液，用磷酸缓冲液洗涤菌体细胞。将菌体悬浮于SMM缓冲液(0.5mol/L蔗糖，20mol/LMgCl2，0.02mol/L顺丁烯二酸，pH6.5)中。取菌液0.1mL，用无菌水倍比稀释，涂布平板培养基，30℃培养4d后测定菌落总数。在剩余的菌悬液中加入不同浓度的EDTA、溶菌酶，混合均匀后于适当温度保温一定时间，4000r/min离心10min，弃上清液，用高渗缓冲液(0.1mol/L磷酸氢二钠，0.1mol/L磷酸二氢钠，0.8mol/L甘露醇pH7.0)洗涤除酶，取菌液0.1mL，用无菌水倍比稀释，进行剩余菌数的测定。(4)原生质体的再生取0.1mL酶解后的原生质体悬液，用SMM缓冲液倍比稀释，取1mL加入底层补充基本培养基(蔗糖180g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，琼脂粉20g/L，pH7.0±0.5)的中央，再倒入上层的补充再生培养基(蔗糖180g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，琼脂粉8g/L，pH7.0±0.5)，混匀，30℃培养4～5d。一种韦兰胶合成菌原生质体制备与再生的方法，其最佳条件为：菌龄10h，在发酵液中加入12mmol/L的EDTA预处理，溶菌酶浓度45μg/mL，酶解温度28℃，酶解时间25min。本专利技术的有益效果：本专利技术关于，操作简单，重复性强。利用本方法制备的韦兰胶合成菌的原生质体形成率达97.3％，再生率达33.9％，活性高，有利于后续融合育种的操作。附图说明图1韦兰胶合成菌的细胞形态图2韦兰胶合成菌的原生质体形态图3EDTA浓度对原生质体形成率与再生率的影响图4酶浓度对原生质体形成率与再生率的影响图5酶解温度对原生质体形成率与再生率的影响图6酶解时间对原生质体形成率与再生率的影响图7融合子0102的细胞形态图8融合子0102发酵24小时的摇瓶照片图9融合子产物0.5％水溶液的流变学曲线具体实施方式实施例1：取保藏的菌种Sphingomonassp，在无菌操作条件下将其划线到试管斜面上，30℃恒温培养72h。用5mL无菌水将试管斜面上的菌体冲洗下来，接种量将其接种到100mL液体培养基中，30℃，180r/min摇床培养10h，加入12mmol/LEDTA处理。取菌液在8000r/min条件下离心5min，弃上清液，用磷酸缓冲液洗涤菌体细胞，显微镜观察细胞形态(图1)。将菌体悬浮于SMM缓冲液中，进而用无菌水倍比稀释，涂布平板培养基，30℃培养4d后得菌落数A(菌落总数)。同样条件下，再次离心并弃上清液，用45μg/mL溶菌酶悬浮细胞，28℃保温25min，4000r/min离心10min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，显微镜观察细胞形态(图2)，取菌液0.1mL，用无菌水倍比稀释，进行剩余菌数B(未被酶裂解的剩余细胞)的测定。取0.1mL酶解后的原生质体悬液，用SMM缓冲液倍比稀释，取1mL加入底层补充基本培养基的中央，再倒入上层的补充再生培养基，混匀，30℃培养4～5d后计数，将菌落数计为C(再生菌落数)。原生质体形成率与再生率的计算公式如下：原生质体形成率(％)＝(A-B)/A×100原生质体再生率(％)＝(C-B)/(A-B)×100在菌龄10h的发酵液中加入12mmol/LEDTA预处理，溶菌酶浓度45μg/mL，酶解温度28℃，酶解时间25min时，得到的原生质体形成率为97.3％，再生率为33.9％。实施例2：取保藏的菌种Sphingomonassp，在无菌操作条件下将其划线到试管斜面上，30℃恒温培养72h。用5mL无菌水将试管斜面上的菌体冲洗下来，接种量将其接种到100mL液体培养基中，30℃，180r/min摇床培养10h，加入12mmol/LEDTA处理。取菌液在8000r/min条件下离心5min，弃上清液，用磷酸缓冲液洗涤菌体细胞。将菌体悬浮于SMM缓冲液中，用125μg/mL溶菌酶悬浮细胞，37℃保温30min，4000r/min离心10min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，该处理过程获得的原生质体形成率为88.0％，再生率为25.0％。实施例3：取保藏的菌种Sphingomonassp，在无菌操作条件下将其划线到试管斜面上，30℃恒温培养72h。用5mL无菌水将试管斜面上的菌体冲洗下来，接种量将其接种到100mL液体培养基中，30℃，180r/min摇床培养10h，加入12mmol/LEDTA处理。取菌液在8000r/min条件下离心5min，弃上清液，用磷酸缓冲液洗涤菌体细胞。将菌体悬浮于SMM缓冲液中，用45μg/mL溶菌酶悬浮细胞，37℃保温30min，4000r/min离心10min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，该处理过程获得的原生质体形成率为73.0％，再生率为31.1％。实施例4：取保藏的菌种Sphingomo本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种韦兰胶合成菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：菌种液体培养的PJ培养基：酵母粉2.5g/L，麦芽浸粉0.25g/L，pH 7.0±0.5。原生质体制备条件：菌龄8～13h，在发酵液中加入10～14mmol/L的EDTA预处理，溶菌酶浓度15～85μg/mL，酶解温度25～30℃，酶解时间20～30min。原生质体再生的补充基本培养基：蔗糖180g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0±0.5。补充再生培养基：蔗糖180g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，琼脂粉8g/L，pH 7.0±0.5。

【技术特征摘要】
1.一种韦兰胶合成菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于：菌种液体培养的PJ培养基：酵母粉2.5g/L，麦芽浸粉0.25g/L，pH7.0±0.5。原生质体制备条件：菌龄8～13h，在发酵液中加入10～14mmol/L的EDTA预处理，溶菌酶浓度15～85μg/mL，酶解温度25～30℃，酶解时间20～30min。原生质体再生的补充基本培养基：蔗糖180g/L，蛋白胨5g...

【专利技术属性】
技术研发人员：张芃，黄海东，李晓雁，周明明，任梦楠，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津;12