本发明专利技术涉及一种用于亚细胞定位的大豆叶片原生质体分离方法。以湘豆3号大豆幼嫩叶片为材料，通过控制质壁分离时间，纤维素酶Onozuka R-10、半纤维素酶Hemicellulase、离析酶Macerozyme R-10及果胶酶Pectolyase Y-23的配比及浓度、酶解液中甘露醇浓度、酶解液pH、酶解时间等因素，筛选出分离湘豆3号大豆叶片原生质体最适合的条件。本发明专利技术所述方法获得的游离原生质体数量多，活性较高，且用于亚细胞定位效果较好，是一种简便、快捷分离湘豆3号大豆叶片原生质体的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及，属于生物技术领 域。
技术介绍
植物基因型对原生质体的分离影响很大，湘豆3号大豆是我们研究的主要大豆材 料，但有关湘豆3号大豆原生质体分离的方法尚未见报道。我们W大豆品种湘豆3号的幼 嫩叶片为材料，建立了湘豆3号叶片原生质体分离体系，此专利技术将为我们开展基因瞬时表 达及蛋白的亚细胞定位研究提供重要的技术支持。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种用于亚细胞定位的大豆叶片原生质体分离方 法。 技术方案：本专利技术通过调节质壁分离时间、酶种类及配比、酶解液中甘露醇浓度、 酶解液pH、酶解时间等因素，筛选出分离湘豆3号大豆叶片原生质体最适宜的因素。其目的 是运样实现的，，具体包括W下实施方 式。 阳0化](1)样品筛选：取10-30d苗龄的湘豆3号大豆幼苗上完全展开的幼嫩叶片，要求 叶片健壮且大小适中，清洗叶片表面，除去灰尘杂质。 (2)将清洗的叶片用刀片切成0.5-1mm的细条，置于盛有质壁分离液的培养皿中 黑暗条件下进行质壁分离，所述的质壁分离液为CPW(细胞原生质体清洗液）+13%甘露醇。 (3)将经过质壁分离后的叶片细条转移至盛有酶解液的培养皿中，置于摇床上黑 暗条件下进行酶解，一段时间后发现酶解液中已无完整叶片细条，而溶液转为绿色后，将 溶液制片于显微镜下观察，视野下会出现大量圆形的原生质体；其中所述的酶解液为CPW +0. 1%MES+0. 5% 纤维素酶Onoz址aR-IO+ 0.8% 半纤维素酶Hemicellulase+ 0.8%离析 酶MacerozymeR-IO+ 0.4% 果胶酶F*ectolyaseY-23。 根据上述方法，其特征在于，所述材料优选湘豆3号大豆幼嫩叶片。 根据上述方法，其特征在于，步骤（2)中的质壁分离时间优选2h。 根据上述方法，其特征在于，步骤（3)中的酶解液组合优选CPW+0. 1%MES+0. 5% 纤维素酶Onoz址aR-IO+ 0.8% 半纤维素酶Hemicellulase+ 0.8% 离析酶Macerozyme R-IO+ 0.4% 果胶酶化CtolyaseY-23+甘露醇。 根据上述方法，其特征在于，步骤（3)中酶解液中的甘露醇浓度优选10%。 根据上述方法，其特征在于，步骤（3)中的酶解液抑优选6.0。 根据上述方法，其特征在于，步骤（3)中的酶解时间优选6h。 有益效果：本方法简单实用，分离材料易于获得；酶解方法简单，获得的原生质体 数量多且活性高。本项技术将为基因瞬时表达及蛋白的亚细胞定位重要技术支持。【附图说明】 图1湘丑3号大丑叶片原生质体不意图。 图2和台吩蓝染色后的湘豆3号大豆叶片原生质体示意图。 阳017] 图3湘豆3号大豆叶片原生质体用于亚细胞定位示意图。【具体实施方式】 为了加深对本专利技术的理解，下面将结合实施例对本专利技术作进一步详述，运些实施 例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术保护范围的限定。 实验材料：10-30d的湘豆3号大豆幼嫩叶片或成熟苗上的幼嫩叶片。 实施例中，CPW溶液的配方为。 实施例中，W5溶液的配方为。 实施例中，MMG溶液的配方为。 实施例中，WI溶液的配方为。 将W5溶液、MMG溶液及WI溶液用KOH调抑至5. 7，12rC灭菌20min，4°C保存备 用。 阳0巧]原生质体分离。 (1)取幼嫩湘豆3号大豆叶片，用自来水清洗干净后用纯水清洗，备用。 (2)将步骤上述湘豆3号大豆幼嫩叶片切成0.5-1mm的细条，置于质壁分离液 (CPW+13%甘露醇）中，室溫、黑暗条件下进行质壁分离，用綴子辅助使叶片完全浸入溶液中。 质壁分离2h。 (3)将步骤（2)中的叶条转移至酶解液中、溫度27°C、转速为45巧m、黑暗条件下 酶解6h，酶解液成分为：细胞原生质体清洗液CPW+10%甘露醇+0. 1%MES+0. 5%纤维素 酶Onoz址aR-IO+ 0.8% 半纤维素酶Hemicellulase+ 0.8% 离析酶MacerozymeR-IO+ 0. 4% 果胶酶F*ectolyaseY-23,抑为 6. 0。 (4)将步骤（3)中分离得到的叶片原生质体进行检测：取10化原生质体溶液加入 2化0.4%的台吩蓝染液混合均匀，用血球计数板制片后置于光学显微镜下观察，视野中未 被染色的为活的原生质体，被染成蓝色的为失去活力的原生质体。原生质体产量(原生质体 产量=25个方格内原生质体总数/0. 1X1000X10个/g-FW)为1.75X IO7个/g-FW，存 活率为82. 86〇/〇。 原生质体转化。 (5)用S层75化的尼龙网膜过滤酶解后的混合物，弃滤渣；滤液上层缓慢滴加等 渗的W5溶液，冰上静置30minW上，待溶液分层。 阳03引 （6)吸取中层10血的原生质体，用10血W5溶液洗涂（200g离屯、2min,弃上 清)，2-3次，即获得较为纯净的原生质体。 (7)原生质体转化：W阳G为媒介，将带有35S驱动的绿色巧光蛋白GFP的质粒 pA7转化进入原生质体：转化体系如下：15化质粒，100化原生质体用MMG溶液溶解，115 化40%的阳G-化Clz;室溫放置10-20min,然后加入400-440化W5溶液W终止反应；200 g离屯、2min,去上清；再加入1血WI溶液悬浮原生质体，于28°C黑暗条件下培养12-24小 时。 上述实施例只为说明本专利技术的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人 ±能够了解本专利技术的内容并据W实施，并不能W此限制本专利技术的保护范围，凡根据本专利技术 精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。【主权项】1. 一种快速高效制备湘豆3号大豆叶片原生质体的方法，其特征在于，所述方法包括 以下步骤。 (1) 样品筛选：取10-30d苗龄的湘豆3号大豆幼苗上完全展开的幼嫩叶片，要求叶片 健壮且大小适中，清洗叶片表面，除去灰尘杂质。 (2) 将清洗的叶片用刀片切成0.5-1mm的细条，置于盛有质壁分离液的培养皿中黑暗 条件下进行质壁分离，所述的质壁分离液为CPW(细胞原生质体清洗液）+13%甘露醇。 (3) 将经过质壁分离后的叶片细条转移至盛有酶解液的培养皿中，置于摇床上黑暗条 件下进行酶解，一段时间后发现酶解液中已无完整叶片细条，而溶液转为绿色后，将溶液制 片于显微镜下观察，视野下会出现大量圆形的原生质体；其中所述的酶解液为CPW+0. 1% MES+0. 5% 纤维素酶OnozukaR-IO+ 0.8% 半纤维素酶Hemicellulase+ 0.8% 离析酶 MacerozymeR-10 + 0.4% 果胶酶PectolyaseY_23〇2. 根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述材料为湘豆3号大豆幼嫩叶片。3. 根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中的质壁分离时间为2 h。4. 根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3 )中的酶解液组成为CPW+0. 1% MES+0. 5% 纤维素酶OnozukaR-IO+ 0.8% 半纤维素酶Hemicellulase+ 0.8% 离析酶 MacerozymeR-10 + 0.4% 果胶酶PectolyaseY-23+甘露醇。5. 根据权利要求书1所述的方法，其本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速高效制备湘豆3号大豆叶片原生质体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤。（1） 样品筛选：取10‑30 d苗龄的湘豆3号大豆幼苗上完全展开的幼嫩叶片，要求叶片健壮且大小适中，清洗叶片表面，除去灰尘杂质。（2） 将清洗的叶片用刀片切成0.5‑1 mm的细条，置于盛有质壁分离液的培养皿中黑暗条件下进行质壁分离，所述的质壁分离液为CPW（细胞原生质体清洗液）+13%甘露醇。（3） 将经过质壁分离后的叶片细条转移至盛有酶解液的培养皿中，置于摇床上黑暗条件下进行酶解，一段时间后发现酶解液中已无完整叶片细条，而溶液转为绿色后，将溶液制片于显微镜下观察，视野下会出现大量圆形的原生质体；其中所述的酶解液为CPW +0.1% MES+0.5% 纤维素酶Onozuka R‑10 + 0.8% 半纤维素酶Hemicellulase + 0.8%离析酶Macerozyme R‑10 + 0.4% 果胶酶Pectolyase Y‑23。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：舒英杰，周玉丽，陶源，胡能兵，何庆元，黄守程，
申请(专利权)人：安徽科技学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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