本发明专利技术公开了一种皇帝蕉的离体再生和遗传转化的方法及其离体再生培养基。本发明专利技术以皇帝蕉雄花薄片为外植体，采用离体再生培养基诱导获得不定芽，将不定芽的切片作为转化受体，通过基因枪和农杆菌介导法相结合的方法将T-DNA插入到皇帝蕉基因组中，得到转基因皇帝蕉。通过试验证明：与单独基因枪法转化和单独农杆菌介导法相比，本发明专利技术的方法转化效率高且转化周期短。本发明专利技术建立了适合皇帝蕉的高效遗传转化体系，为通过生物技术手段培育皇帝蕉新品种奠定了基础，更为今后皇帝蕉乃至其它香蕉基因功能的鉴定及转基因新品种的培育提供技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体设及一种皇帝蕉的离体再生和遗传转化的方法及 其离体再生培养基。
技术介绍
皇帝蕉（MusaacuminataCV.Mas)属单子叶植物纲、芭蕉科（Musaceae)芭蕉属 (Musa)植物，原产印度尼西亚，印尼称其为Pisanmas，是独特的食用二倍体（AA型）蕉。20 世纪50年代末由华侨李木清从印尼引进我国海南省兴隆种植。皇帝蕉又称贡蕉、帝王蕉、 米香蕉、金香蕉等，抗病能力较强，果实小巧美观、饱满、皮薄、含多种维生素，备受消费者青 睐，是世界上公认的高档香蕉品种之一（魏岳荣，2005 ;王丽萍，2014)，但与普通香蕉相比， 皇帝蕉产量较低，肉质较硬，偏酸，因此其产量和品质风味等均有待进一步提高。 皇帝蕉虽然是二倍体，但是无巧，具有高度不育性，因此很难用传统育种方法培育 生产实践中所需要的新品种。转基因技术的发展为皇帝蕉育种提供了一种行之有效的手 段。转基因育种成功与否取决于高效离体再生体系和遗传转化体系的建立。2005年，魏岳 荣等W皇帝蕉未成熟雄花序的第1~15位花梳为外植体，建立和优化了胚性细胞悬浮系。 虽然胚性细胞悬浮系被认为是转基因理想的受体材料，但是诱导和保持皇帝蕉胚性细胞悬 浮系非常困难，胚性愈伤发生率低，胚性细胞再生率低，再生周期长，从胚性愈伤分化成苗 相当困难。运些一直都是制约皇帝蕉转基因研究的瓶颈因素。目前较常用的遗传转化方法 有农杆菌介导法和基因枪法，运些方法在其它香蕉品种如己西香蕉上有遗传转化取得成功 的报道（胡春华等，2010a;2010b;2014;Yipetal.，2011 ;化agetal.，2012;KovCSet al.,2013;Vishnevetskyetal.,2011)，然而香蕉遗传转化对品种的依赖性非常强，而且 香蕉是单子叶植物，不是农杆菌的理想宿主，已有报道都是采用单独一种方法进行转化且 转化效率较低，关于皇帝蕉转化成功的报道仅有一例，是采用农杆菌介导法转化胚性细胞 悬浮系化uangetal. , 2007)。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种离体再生培养基。 阳0化]本专利技术提供的离体再生培养基是将6 -苄基嚷岭、1-苯基-3-(1，2,3,-嚷二 挫-5-基）脈、薦糖、凝固剂与液体MS培养基混匀得到的。 上述离体再生培养基中，所述6-苄基嚷岭在所述离体再生培养基中的浓度为 0. 5-2. 5mg/L； 所述1-苯基-3-(1，2,3,-嚷二挫-5-基）脈在所述离体再生培养基中的浓度为 0. 5-2. 5mg/L； 所述薦糖在所述离体再生培养基中的浓度为35-40g/L; 所述凝固剂在所述离体再生培养基中的浓度为6. 8-7. 5g/L。 上述离体再生培养基中，所述凝固剂为琼脂； 所述6-苄基嚷岭在所述离体再生培养基中的浓度为2mg/L; 所述1-苯基-3-(1，2,3,-嚷二挫-5-基）脈在所述离体再生培养基中的浓度为 2mg/L; 所述薦糖在所述离体再生培养基中的浓度为40g/L; 所述琼脂在所述离体再生培养基中的浓度为7g/L。 本专利技术的另一个目的是提供上述离体再生培养基的新用途。 本专利技术提供了上述离体再生培养基在皇帝蕉雄花的离体再生培养中的应用。 本专利技术还提供了上述离体再生培养基在培育转基因皇帝蕉中的应用。 本专利技术还有一个目的是提供一种皇帝蕉雄花不定芽的离体再生培养方法。 本专利技术提供的皇帝蕉雄花不定芽的离体再生培养方法包括如下步骤：将皇帝蕉雄 花在上述再生离体培养基中进行离体再生培养，得到带有不定芽，实现离体再生培养。 本专利技术的最后一个目的是提供一种制备转外源DNA皇帝蕉的方法。 本专利技术提供的制备转外源DNA皇帝蕉的方法包括如下步骤： 1)按照上述方法，获得不定芽； 2)将所述不定芽薄片作为转化受体，依次进行基因枪转化和农杆菌转化，得到转 化后的外植体； 3)将转化后的外植体进行培养，得到转外源DNA的皇帝蕉。上述方法中，所述不定芽薄片的厚度为l-2mm。 上述方法中，所述将转化后的外植体进行培养的方法为将所述转化后的外植体置 于培养基A中在28°C、黑暗的条件下培养2天；再转置培养基B中在28°C、黑暗的条件下培 养45天，得到白色小芽；然后将白色小芽转置光照（光照强度为15001X，光照周期为1化光 照/I化黑暗）条件下培养；待不定芽长到3-5cm长时切下，转置培养基C上在光照（光照 强度为15001X，光照周期为1化光照/I化黑暗）条件下培养，得到所述转外源DNA的皇帝 蕉。 上述方法中，所述培养基A由BA化一苄基嚷岭）、TDZ(1-苯基-3-(1，2,3，-嚷二 挫-5-基）脈）、AS(乙酷下香酬）、薦糖、琼脂和液体MS培养基组成，其中，BA在培养基A 中的浓度为2mg/l，TDZ在培养基A中的浓度为2mg/l，薦糖在培养基A中的浓度为40g/l， 琼脂在培养基A中的浓度为7g/L，AS在培养基A中的浓度为250yM; 所述培养基B是由BA化一苄基嚷岭）、TDZ(1-苯基-3-(l，2,3，-嚷二挫-5-基） 脈）、G418 (庆大霉素衍生物）、特美汀、薦糖、琼脂和液体MS培养基组成，其中，BA在培养基 B中的浓度为2mg/l，TDZ在培养基B中的浓度为2mg/l，薦糖在培养基B中的浓度为40g/ L琼脂在培养基B中的浓度为7g/l，G418在培养基B中的浓度为lOOmg/l，特美汀在培养 基B中的浓度为200mg/L。 所述培养基C是由G418和液体MS培养基组成，其中，G418在培养基C中的浓度 为 25mg/L。 本专利技术W皇帝蕉雄花薄片为外植体，采用离体再生培养基诱导获得不定芽，将不 定芽的切片作为转化受体，通过基因枪和农杆菌介导法相结合的方法将T-DNA插入到皇帝 蕉基因组中，得到转基因皇帝蕉。通过试验证明：与单独基因枪法转化和单独农杆菌介导法 相比，本专利技术的方法转化效率高且转化周期短。本专利技术建立了适合皇帝蕉的高效遗传转化 体系，为通过生物技术手段培育皇帝蕉新品种奠定了基础，更为今后皇帝蕉乃至其它香蕉 基因功能的鉴定及转基因新品种的培育提供技术支撑。【附图说明】图1为皇帝蕉的离体再生和遗传转化示意图。其中，图1A为10cm长的皇帝蕉雄 花；图1B为皇帝蕉雄花薄片即外植体；图1C为带有粗壮不定芽的外植体；图1D为不定芽 切片即转化受体；图1E、图1F和图1G为转化后受体材料经离体培养诱导的粗壮芽体；图1H 为生根苗；图II为移栽苗。 阳03引图2为转基因皇帝蕉的GUS检测。其中，图2A为转基因皇帝蕉抗性芽的GUS染色； 图2B为阴性对照； 图3为转基因皇帝蕉的分子检测。其中，图3A为PCR检测；图3B为Southernblot 检测。【具体实施方式】 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 下述实施例中的皇帝蕉（MusaacuminataCV.Mas)雄花是中国热带农业科学院 热带生物技术研究所澄迈香蕉种植园的产品，公众可从中科院遗传与发育生物学研究所获 得。 下述实施例中的PCAS04质粒在文献"奮晨光.一个基于水稻T-DNA插入突变体库 生成的农杆菌介导的一步转化系统的建立.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种离体再生培养基，是将6－苄基嘌呤、1‑苯基‑3‑(1，2，3，‑噻二唑‑5‑基)脲、蔗糖、凝固剂与液体MS培养基混匀得到的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘菊华，金志强，徐碧玉，贾彩红，张静，张建斌，苗红霞，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南;66
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