转化的植物细胞的取得方法技术

本发明专利技术涉及一种转化的植物细胞的取得方法。本发明专利技术包含以下的步骤：(a)将所期望的DNA和第一标记基因在植物细胞中进行共转化的步骤；及(b)从步骤(a)中得到的转化的植物细胞中选择在其染色体中导入所期望的DNA、且没有导入第一标记基因的转化细胞的步骤，但是，所述方法不包含通过使用所述第一标记基因的阳性选择而除去仅将所期望的DNA导入染色体的转化细胞的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种转化的植物细胞的取得方法及转化植物的制备方法。
技术介绍
植物的转化在将植物进行转化时，可利用向植物细胞导入DNA的技术，所述技术能够在稔实种子的后代或营养繁殖体中使外来基因维持并表达。可以使用该技术实际地转化许多单子叶植物、双子叶植物。在植物生理学、植物分子生物学的领域中，拟南芥(Arabidopsis thaliana)、稻、短柄草属(Brachypodium)等的转化体经常用于基础研究。在作物中，玉米、稻、小麦、大麦、高梁、大豆、油菜籽、向日葵、棉、马铃薯、番茄等不用说，即使水果类或其它蔬菜类，也可制备转化体。另外，可以通过转化赋予高附加价值的特性，因此，对商业用途存在强烈的兴趣，目前，转化的玉米、大豆、油菜籽、棉正在广泛地进行商业生产。但是，制备转化植物时，在研究方面及商业利用方面这两者中存在重要的问题。其为制备的转化体大多保持多拷贝的目标DNA的情况。在多拷贝数导入有目标DNA的转化植物中，导入基因的表达量在植物间较大变化，导入基因的表达受到强烈抑制(一种被称为同源性依赖性基因沉默的现象)的植物的情况不少。另一方面，仅以单拷贝保持目标DNA的转化体与基因组上的插入位置没有关系，显示稳定的基因表达(Nagaya et al.，2005)。在同源性依赖性基因沉默中存在转录后型(PTGS)和转录型(TGS)这2种，两者均介由双链RNA而产生，但PTGS在多拷贝的目标DNA相互沿正向或反向连接而导入的情况、或在部分缺失的目标DNA一起被导入的情况下容易产生。TGS因表遗传学而被发动，一般而言伴随通过与基因上游的启动子区域同源的小RNA的DNA甲基化。该甲基化即使经过体细胞分裂或减数分裂也被维持，结果，沉默遗传给后代(Eamens et al.，2008)。另外，由于拷贝数较高，目标DNA对基因组的整合方面变得复杂且更难
以分析。因此，对于大多数转化目的，如在1)在转化体中以表达水平评价导入基因的效果、2)在转化体中评价启动子或转录因子的特性、3)制备T-DNA标签库、4)以商业化为目标制备转化植物的目的，优选以1-2拷贝导入目标DNA，最优选以单拷贝导入。在植物的转化方法中，已知有粒子枪法、电穿孔法、电注射法、聚乙二醇法、须晶法等物理化学的方法(DNA的直接导入法)和利用土壤杆菌属细菌具有的功能的生物学方法(DNA的间接导入法)。在直接导入法中，目标DNA被片段化而被导入、以高拷贝数(多的时候达到100拷贝)被导入的现象以高频率产生(Butaye et al.，2005)。另外，多拷贝导入目标DNA时，各拷贝经常彼此连接而被整合到相同的基因座(Kohli et al.，1998；Klein，2010)。因此，显示目的基因未得到表达的基因沉默现象的转化体以高频率出现(Register et al.，1994)。在土壤杆菌法中，通过Ti或Ri质粒的毒力区域(vir区域)中的基因簇的表达控制而导入目标DNA。目标DNA通过vir基因所编码的蛋白质簇的作用，经过植物细胞和细菌的相互作用的识别和信号传递、vir基因的表达诱导、类型IV分泌路径的形成、T-DNA边界重复序列的认识、T-DNA链的形成、将T-DNA链转移到植物细胞和然后到核、和T-DNA对植物核基因组的整合等的许多过程而被导入。因此，与直接导入法相比时，更低保持目标DNA的导入拷贝数(低于10拷贝)，被片段化而被导入的情况也少(Shou et al.，2004；Butaye et al.，2005)。土壤杆菌法与DNA的直接导入法相比，为优异的转化方法，尽管如此，不能充分地控制向基因组导入的DNA的拷贝数。另外，多拷贝的DNA向相同基因座导入也并不罕见(Wang and Waterhouse，2000)。因此，在目的基因的表达量上产生某种程度的植物间差异，有时产生伴有同源性依赖性基因沉默的植物(Butaye et al.，2005；Nagaya et al.，2005)。控制导入DNA的拷贝数的尝试由于此类
技术介绍
，以低拷贝导入目标DNA的方法也报道有数件。这些方法之一为使用位点特异性重组系统的方法。首先，将在具有选择标记的所期望的DNA的两侧沿反向方向有位点特异性重组酶的识别序列(lox)的DNA片段导入植物。另外，预先将Cre表达盒导入另一个植物。接着，将导入有多个连接的目标DNA拷贝的T0植物和表达Cre的T0植物进行杂交。在得到的F1植物中表达Cre时，从导入多个连接拷贝的DNA区域仅将由DNA
区内的正向lox序列之间夹持的DNA区域全部切出。其结果，保留在DNA中的两个末端彼此连接，可得到仅具有单拷贝的目标DNA的细胞。通过该细胞分化为生殖细胞，可以得到以单拷贝或单拷贝纯合含有目标DNA的F2植物(Srivastava et al.，1999；DeBuck et al.，2007)。但是，杂交的方法存在着得到目的植物之前花费长时间的缺点。另外，在引起表遗传性的TGS的情况下，即使通过Cre-lox反应而降低拷贝数，所期望的DNA的表达仍受到抑制。另外，作为类似使用位点特异性重组系统的方法，也报道有将上述的目标DNA片段和具有Cre基因的DNA片段进行共转化的方法(Srivastava and Ow，2001)。共转化的Cre表达时，从导入多个连接的目标DNA拷贝的区域切出由lox序列间所夹持的区域，并且可以在T0世代得到目标DNA单拷贝的植物。但是，在共转化法中，如果Cre基因自身进行多拷贝导入，则有时由于表达抑制而不起作用。根据Butaye等(2005)的评论，使用位点特异性重组系统的拷贝数减少方法理论上可行，但成功例的报道少，并且转化效率也较低。顺便说一下，在该方法中，也指出夹持于2个导入DNA拷贝之间的野生型的基因组区域被切出并且缺失的问题(Butaye et al.，2005)。这些方法中的第二个为在土壤杆菌法中使用毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的oriRi作为具有目标DNA的T-DNA的载体的复制起点的方法。Ye等(2011)通过使用oriRi起作用的二元载体和作为IncP RK2型复制起点的oriV起作用的二元载体比较植物频率，在所述植物中以单拷贝导入有目标DNA，而不包含对应于得到的转化体中的T-DNA外侧的载体的骨架序列。通过使用oriRi载体获得的单拷贝导入植物的频率在转化的大豆植物中是38％-40％，这与通过使用oriV载体获得的频率相比是加倍的，在转化的油菜籽植物中是51％，这高1.5倍，并且在转化的玉米植物中是58％，这高1.4倍。另一方面，转化效率减少，将oriV载体的情况设为100％时，在大豆中显示45％-68％，在油菜籽中显示80％，在玉米中显示58％(Ye et al.，2011)。考虑通过使用oriRi载体得到的无骨架单拷贝转化体的制备频率以及转化效率获得的每个测试材料的制备效率与通过使用oriV载体获得的效率相比时，在大豆中高0.96-1.36倍，在油菜籽中高1.2倍，在玉米中高0.82倍。可以说，即使每测试材料的制备效率较低，只要整体上操作效率或成本效率较高，oriRi二元载体可以认为是有用的。就转化体的分析而本文档来自技高网...

【技术保护点】
转化的植物细胞的取得方法，其包含以下的步骤：(a)将所期望的DNA和第一标记基因在植物细胞中进行共转化的步骤；及(b)从步骤(a)中得到的转化的植物细胞中选择在其染色体中导入了所期望的DNA、且没有导入第一标记基因的转化的植物细胞的步骤，但是，所述方法不包含通过使用所述第一标记基因的阳性选择而除去仅将所期望的DNA导入了染色体的转化细胞的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.06 JP PCT/JP2014/0527651.转化的植物细胞的取得方法，其包含以下的步骤：(a)将所期望的DNA和第一标记基因在植物细胞中进行共转化的步骤；及(b)从步骤(a)中得到的转化的植物细胞中选择在其染色体中导入了所期望的DNA、且没有导入第一标记基因的转化的植物细胞的步骤，但是，所述方法不包含通过使用所述第一标记基因的阳性选择而除去仅将所期望的DNA导入了染色体的转化细胞的步骤。2.如权利要求1所述的方法，其中，第一标记基因为阴性选择标记基因。3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中用于共转化的所期望的DNA和第一标记基因的混合比率为3:1-1:5。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在用于步骤(a)的所期望的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：樋江井佑弘，小鞠敏彦，
申请(专利权)人：日本烟草产业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP