本发明专利技术公开了一种提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，包括样品的预处理、精子悬液的制作、精子的悬浮处理、精子膜蛋白分离、精子膜蛋白去脂纯化、精子膜蛋白的SDS-PAGE检测以及精子膜蛋白质谱检测的步骤；本方法在传统去污法的基础上，拟合了蛋白酶抑制剂和TM-PEK法的特点，所提取的鱼类精子膜蛋白盖度达到86%以上，平均每5×107个精子中可得到0.6mg膜蛋白和0.8mg胞质蛋白。本发明专利技术专利方法的推广应用可以为鱼类精卵作用机制以及受精机理的探明提供基础资料；可以为鱼类的增养殖尤其是江海洄游性鱼类的生殖繁育提供指导；可以为其他水生生物物种的精子膜蛋白研究提供有用的参考方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物精子检测领域，特别涉及。
技术介绍
动物的精子是一类结构和功能都十分特化的细胞，精子膜表面存在多种膜蛋白和蛋白受体复合物等，它们与精子发生、成熟获能、精卵识别、受精过程等生殖生物学活动有重要功能。精子膜表面蛋白是精子发生、成熟和精卵相互作用的重要分子，对其深入研究有助于揭示精子发生、成熟获能和受精的生物学机制。成熟精子的质膜表面含有多种蛋白，它们自身固有或是外界粘附到精子表面，在维持精子形态结构完整等过程中发挥着重要的作用，特别是与精卵识别结合以及质膜融合等过程密切相关。因此精子膜蛋白组分的测定对于探索鱼类精子获能，精卵识别和生殖过程的生物学机制是非常重要的。精子膜蛋白抽提方法通常是使用去污剂、超声破碎、蔗糖密度梯度离心、生物素化等方法进行。抽提得到的精子膜蛋白往往需要透析浓缩(李彦臻等，2008)，精子悬液悬浮处理(潘洪强，2001)和利用链亲和素对膜蛋白进行分离富集和洗脱等(Shetty etal.，20 01)等步骤。这些步骤的会导致所提取精子膜蛋白的量和纯度。目前，对人类和其他一些哺乳动物的精子膜蛋白研究报道较多，一些水生生物如海胆(Echinoidea)和鲍(Haliotis)是目前研究较多的实验材料。但有关鱼类精子膜蛋白的研究均未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供。本专利技术是由以下技术手段实现的:，按照以下步骤进行:(I)对所采集的鱼类精巢或成熟精子样本使用PBS与质量浓度为0.7%NaCl的漂洗缓冲液进行漂洗，除去碎屑物质，得到样品液；(2)缓冲漂洗后，采用悬浮缓冲液对样品进行悬浮处理0.5-lh ;加悬浮缓冲液再进行悬浮处理l_2h ;取悬浮上清液加精子膜蛋白分离液，混匀，置摇床上，冰浴缓慢振摇1.5h，然后4°C离心，上清为精子膜蛋白溶液，沉淀为脱膜精子；(3)将得到的精子膜蛋白溶液转移至试管中，在25°C下孵育15-20分钟，对混合物进行离心，获得悬液的相分层，上层为水相层，下层为膜蛋白混合物层；留下层液体用于后续的膜蛋白纯化；使用冰浴的TBS将所得膜蛋白粗提物，重复精子膜蛋白的分离步骤，得到较好浓度和纯度的精子膜蛋白，取少量溶液测其蛋白含量，其余_20°C保存备用；(4)对所抽提的精子膜蛋白进行SDS-PAGE电泳，使用5XSDS-PAGE样品溶解液对样品进行处理；(5)对所抽提的精子膜蛋白进行纳米级串联质谱Nano-LC MS/MS技术检测。所述的提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，步骤(1)中使用PBS的浓度可以为0.01M0所述的提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，步骤(2)中4°C离心条件可以为12000r/min,IOmin0所述的提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，步骤(3)中离心条件可以为5000g，20-25分钟。所述的提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，步骤(3)中重复精子膜蛋白的分离步骤可以为2-4次基于对长江刀鲚等江海洄游性鱼类的精子膜蛋白提取和检测的反复验证，本专利技术提供的方法可以高效快速提取鱼类精子膜蛋白，可以平均从5X IO7个精子中可得到0.6mg膜蛋白，0.Smg胞质蛋白，整个提取过程可在2小时内完成。该方法与传统的精子膜蛋白的提取方法相比，具有耗时少，效率高，在其他动物物种的精子膜蛋白研究中都可以推广应用。通过该方法所提取的精子膜蛋白纯度和盖度高，可以用于精子发生和受精生物学的机制研究，研究结果可以为鱼类的增养殖尤其是江海洄游性鱼类的生殖繁育提供指导。本专利方法采用去垢剂法和精子悬液处理的方法提取鱼类精子膜蛋白，具有耗时短，所提精子膜蛋白产量和纯度高的优点。【附图说明】图1是提取长江刀鲚精子膜蛋白的SDS-PAGE检测和WB鉴定图。【具体实施方式】实施例1本实施例以长江刀鲚鱼作为试验对象，进行其精子蛋白的提取和检测。本实施例中所用的试剂以及配制方法如下:(I)A液:0.25M蔗糖，0.1M Tris-HCl,0.5M苯甲酰胺，ImM EDTA，等体积混合得到A液；B液:质量比为5%果糖，0.01M枸橼酸钠，等体积混合得到B液；(2)悬浮缓冲液:由0.01M PBS缓冲液加0.05%链亲和素常规溶液配制方法，等体积混合配制而成，用于后续精子抽提液的悬浮处理悬浮离心收集上清液；(3)精子膜蛋白分离液:l%Triton X-100,1.7%Triton X-114, IM NaCl 溶液，等体积混匀配制成精子膜蛋白分离液，用来提取鱼类的精子膜蛋白；(4) 5 X SDS-PAGE 样品溶解液:5 X loading buffer40ml，Tris 缓冲液 ρΗ6.8 (IM)10ml，甘油 8ml，10%SDS16ml，β -巯基乙醇 4ml，0.11% 溴酚蓝，用 IM HCl 调 pH 至 6.8。1、样品采集与保存:选取鲜活的长江刀鲚精巢组织，术者佩戴医用口罩和塑胶手套等防止采样污染；采样过程需要快速进行(l_2min内完成)，样品立即使用4°C遇冷的PBS缓冲液漂洗。漂洗完成后放置于-20°C低温冰箱保存。2、样品的预处理样品立即使用4°C遇冷的0.01M PBS缓冲液漂洗，倒入消毒好且0.01M PBS与0.7%NaCl的漂洗缓冲液浸润或者冲洗处理的培养皿中静置I小时，除去碎屑等杂质。缓冲漂洗后，采用所配制的悬浮缓冲液对样品进行悬浮处理0.5h-lh ;加悬浮缓冲液再进行悬浮处理l_2h ;取悬浮上清液加精子膜蛋白分离液，混匀，置摇床上，冰浴缓慢振摇1.5h，然后4°C 12000r/min离心lOmin，上清为精子膜蛋白溶液，沉淀为脱膜精子，上清液用于后续的膜蛋白分离。3、精子悬液的制作取制备好的A液与样品液等体积稀释离心，精子沉淀液按体积比1:9加B液重新悬浮，再加入质量浓度为0.05%的乙基苯基聚乙二醇(NP-40)孵育2h至终浓度为含0.05%NP-40。将市场上购得的Triton X-114预浓缩配制得到均质Triton X-114混合物(IOmMTris-HCl pH7.4, 0.15mM EDTA和 PBSl.7%(W/V)Triton X-114) ? 用于后续精子膜蛋白的悬浮分离。 4、精子的悬浮处理在精子悬液中加入蛋白酶抑制剂AntipainlO μ L，防止样品在准备期间蛋白的降解。将样品在4°C下恒温混匀仪中孵育一小时并轻微震荡，4°C高速离心机lOOOOg，离心20分钟。收集上清液用于后续膜蛋白的分离。5、精子膜蛋白分离上述分离所得的上清液在25°C下孵育15-20分钟，混合物在25°C，5000g离心20-25分钟，获得悬液的相分层，上层为水相层，下层为膜蛋白混合物层。留下层液体用于后续的膜蛋白纯化。使用冰浴的TBS(1%W/V Triton X-114)稀释所得下层膜蛋白粗提物，重复精子膜蛋白的分离步骤2-4次，得到较好浓度和纯度的精子膜蛋白。6、精子膜蛋白去脂纯化采用去脂抽提蛋白的方法，对所分离的精子膜蛋白按照1:14体积比，与冰磷酸三丁酯(Tributyl phosphate, TBP):丙酮:甲醇(按体积比I:12:1)混合物混匀，4°C下恒温孵育90分钟。然后于4°C下恒温2800g离心15分钟，然后依次用适量体积(10X)的TBP，丙酮，甲醇沉淀蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：（1）对所采集的鱼类精巢或成熟精子样本使用PBS与质量浓度为0.7%?NaCl的漂洗缓冲液进行漂洗，除去碎屑物质，得到样品液；?（2）缓冲漂洗后，采用悬浮缓冲液对样品进行悬浮处理0.5?1h；加悬浮缓冲液再进行悬浮处理1?2?h；取悬浮上清液加精子膜蛋白分离液，混匀，置摇床上，冰浴缓慢振摇?1.5?h，然后?4?℃?离心，上清为精子膜蛋白溶液，沉淀为脱膜精子；?（3）将得到的精子膜蛋白溶液转移至试管中，在25℃下孵育15?20?分钟，对混合物进行离心，获得悬液的相分层，上层为水相层，下层为膜蛋白混合物层；留下层液体用于后续的膜蛋白纯化；使用冰浴的TBS稀释所得膜蛋白粗提物，重复精子膜蛋白的分离步骤，得到较好浓度和纯度的精子膜蛋白，取少量溶液测其蛋白含量，其余?20℃保存备用；（4）对所抽提的精子膜蛋白进行SDS?PAGE?电泳，使用5×SDS?PAGE样品溶解液对样品进行处理；?（5）对所抽提的精子膜蛋白进行纳米级串联质谱Nano?LC?MS/MS技术检测。
【技术特征摘要】
1.一种提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，其特征在于，按照以下步骤进行: (1)对所采集的鱼类精巢或成熟精子样本使用PBS与质量浓度为0.7% NaCl的漂洗缓冲液进行漂洗，除去碎屑物质，得到样品液； (2)缓冲漂洗后，采用悬浮缓冲液对样品进行悬浮处理0.5-lh ;加悬浮缓冲液再进行悬浮处理1-2 h;取悬浮上清液加精子膜蛋白分离液，混匀，置摇床上，冰浴缓慢振摇1.5h，然后4 V离心，上清为精子膜蛋白溶液，沉淀为脱膜精子； (3)将得到的精子膜蛋白溶液转移至试管中，在25°C下孵育15-20分钟，对混合物进行离心，获得悬液的相分层，上层为水相层，下层为膜蛋白混合物层；留下层液体用于后续的膜蛋白纯化；使用冰浴的TBS稀释所得膜蛋白粗提物，重复精子膜蛋白的分离步骤，得到较好浓度和纯度的精子膜蛋白，取少...
【专利技术属性】
技术研发人员：方弟安，张敏莹，徐东坡，刘凯，周彦锋，段金荣，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：
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