本发明专利技术涉及生物检测技术领域，具体涉及一种B族链球菌荧光定量PCR产前检测引物、探针、试剂盒及其应用。所述引物及对应探针包括用于扩增检测B族链球菌的sip上下游引物、sip Taqman 探针和用于扩增检测人 β-actin的人 β-actin上下游引物、人β-actin Taqman 探针。采用本发明专利技术的检测引物、探针及试剂盒，能够对更低量的DNA样本进行准确的检测，正确率为100%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种B族链球菌荧光定量PCR产前检测引物、探针、试剂盒及其应用。
技术介绍
1938年Fry首次报告3例感染B族链球菌(Group B streptococci,GBS)引起产后心内膜炎的死亡，证实B族链球菌为人类的致病菌。经过几十年的研究，发现B族链球菌可引起新生儿败血症、肺炎、脑膜炎，甚至死亡。在感染后存活的新生儿，还有可能有严重的神经系统后遗症，包括脑积水、智力障碍、小头畸形、耳聋等。同时，B族链球菌还可引起孕妇感染、引起早产、胎儿发育不良(低体重儿)、胎膜早破及晚期流产。GBS，正常寄居于阴道和直肠，它是一种条件致病菌，一般正常健康人群感染GBS并不致病。据统计约10％～30％的孕妇有感染GBS，其中40％～70％在分娩过程中会传递给新生儿。如果新生儿带了这种菌，大约有1％～3％会出现早期侵入性感染，其中有5％会导致死亡。孕妇感染表现为菌血症、泌尿系统感染、胎膜感染、子宫内膜感染以及创伤感染。有报道显示，在2745例产妇中，尿中有感染GBS的胎膜早破发生率为35％。据研究报道GBS阳性的孕妇中有21％发生绒毛膜羊膜炎和产后子宫内膜炎，分析表明GBS阳性是引起绒毛膜羊膜炎的重要危险因素。研究表明，GBS阳性孕妇早产合并低出生体重儿、极低体重儿的可能性增加20％-60％。新生儿感染GBS能够导致败血症，肺炎和脑膜炎，发病率和死亡率较高，也可能遗留长期病理状态如耳聋、视力受损、发育障碍以及脑瘫等。依据美国新哈芬地区10年调查统计结果，其新生儿败血症年发生率为千分之二点七。其新生儿败血症有一半左右都是因B族链球菌感染引起的。基于GBS感染引起孕妇和新生儿相关症状、疾病的严峻性，产前筛查GBS显得尤为重要。常规细菌分离鉴定方法(祝璟琳等,2010)检测周期长,达不到对感染样本快速诊断的要求；靶向于菌体基因组的核酸杂交技术(Rosa et al,1995；Yancey et al,1993),受操作复杂和成本昂贵等因素的制约,也很难用于对疑似感染样本的诊断；靶向于某些编码基因的PCR诊断方法(Mawn et al,1993；Ahmet et al,1999),也仅局限于对某些特定类型菌株的检测,而对其他血清型菌株或溶血型菌株的检测则极易产生假阴性结果。无乳链球菌也极易与其它链球菌属成员菌产生诊断混淆。因此,建立一种快速、准确地检测无乳链球菌,且具有良好特异性和敏感性的检测方法是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种B族链球菌荧光定量PCR检测引物、探针、试剂盒及其应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的第一方面提供了一种B族链球菌荧光定量PCR检测引物及对应探针，所述引物及对应探针包括用于扩增检测B族链球菌的sip上下游引物、sip Taqman探针和用于扩增检测人β-actin的人β-actin上下游引物、人β-actin Taqman探针，sip上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5’-ttgacatcgacaatggcagc-3’；sip下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：5’-taacacttgccactctaggg-3’；sip Taqman探针的核苷酸序列如：SEQ ID NO：3所示，具体为：5’--aacagatacgacgtggacag-3’；人β-actin上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为5’-atcagcaagcaggagtatgacg-3’；人β-actin下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，具体为:5’-tgtgcaatcaaagtcctcgg-3’；人β-actin Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：5’--acctaacttgcgcagaaaac-3’。本专利技术探针的合成为现有技术，探针一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光淬灭基团。优选的，所述sip Taqman探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。更优选的，所述sip Taqman探针5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。优选的，所述人β-actin Taqman探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基
团。更优选的，人β-actin Taqman探针5’端标记的荧光报告基团为HEX荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。本专利技术的第二方面提供了前述B族链球菌荧光定量PCR检测引物、探针在制备B族链球菌检测试剂中的用途。本专利技术的第三方面提供了一种B族链球菌荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液中含有前述引物和探针。本专利技术的试剂盒采用高灵敏性的荧光定量PCR技术来进行B族链球菌检测。不同血清型的S.agalactiae基因组中sip基因高度保守,于是选择sip基因(登录号为DQ650634)为模板分别进行引物设计。采用所述引物进行荧光PCR,进行扩增，根据扩增情况可分析来判断B族链球菌感染情况。因此，引物组的设计是本专利技术试剂盒的关键。基于试剂盒采用的是荧光PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。所述PCR扩增反应液中，引物、Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs均为常见组分，其含量亦为常规。较优的，所述PCR扩增反应液的组成中，sip上游引物的终浓度为0.2pmol/μL，sip下游引物的终浓度为0.2pmol/μL，sip Taqman探针的终浓度为0.4pmol/μL。较优的，所述PCR扩增反应液的组成中，人β-actin上游引物的终浓度为0.2pmol/μL，人β-actin下游引物的终浓度为0.2pmol/μL，人β-actin Taqman探针的终浓度为0.4pmol/μL。更优的，所述PCR扩增反应液的组成及浓度为：每13.2ulPCR扩增反应液中含go Taq Probe qPCR Master 10μL，sip上游引物的终浓度为0.2pmol/μL，sip下游引物的终浓度为0.2pmol/μL，sip Taqman探针的终浓度为0.4pmol/μL，人β-actin上游引物的终浓度为0.2pmol/μL，人β-actin下游引物的终浓度为0.2pmol/μL，人β-actin Taqman探针的终浓度为0.4pmol/μL。PCR扩增反应液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR扩增反应液加入引物及探针配置获得。所述试剂盒中还含有阳性对照。阳性对照含有B族链球菌保守序列，可为含有B族链球菌保守序列的质粒。所述的阳性对照也可以为灭活的B族链球菌培养液。还可采用现有B族链球菌检测试剂盒中的阳性对照，也可单独市购或根据现有技术自行构建。所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种B族链球菌荧光定量PCR检测引物及对应探针，其特征在于，所述引物及对应探针包括用于扩增检测B族链球菌的sip上下游引物、sip Taqman探针和用于扩增检测人β‑actin的人β‑actin上下游引物、人β‑actin Taqman探针，sip上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；sip下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；sip Taqman探针的核苷酸序列如：SEQ ID NO：3所示；人β‑actin上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；人β‑actin下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；人β‑actin Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
【技术特征摘要】
1.一种B族链球菌荧光定量PCR检测引物及对应探针，其特征在于，所述引物及对应探针包括用于扩增检测B族链球菌的sip上下游引物、sip Taqman探针和用于扩增检测人β-actin的人β-actin上下游引物、人β-actin Taqman探针，sip上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；sip下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；sip Taqman探针的核苷酸序列如：SEQ ID NO：3所示；人β-actin上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；人β-actin下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；人β-actin Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。2.根据权利要求1所述的引物及对应探针，其特征在于，所述sip Taqman探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；所述人β-actin Taqman探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。3.根据权利要求1所述的引物及对应探针，其特征在于，所述sip Taqman探针5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；人β-actin Taqman探针5’端标记的荧光报告基团为HEX荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。4.如权利要求1～3任一权利要求所述的B族链球菌荧光定量PCR检测引物、探针在制备B族链球菌检测试剂中的用途。5.一种B族链球...
【专利技术属性】
技术研发人员：程伟，周晖皓，汤华，丁世家，汪德强，潘建华，刘萍，
申请(专利权)人：重庆贝羿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。