一种用于抑制VHL基因表达的抑制剂及其制备制造技术

本发明专利技术公开了一种用于抑制VHL基因表达的抑制剂，所述抑制剂为包含有miR-331-3p基因片段的表达载体，所述表达载体由pTARGET质粒改造获得，具体的，是在pTARGET质粒的多克隆位点区域中插入一段包含miR-331-3p基因片段的插入序列。本发明专利技术还进一步公开了所述抑制剂的制备方法以及在抑制VHL基因表达中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种用于抑制VHL基因表达的抑制剂及其制备
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于抑制VHL基因表达的抑制剂及其制备。
技术介绍
MiRNA的表达及调节异常常见于大量人类肿瘤中，包括肝细胞性肝癌(HCC)。在HCC细胞系中，miRNA芯片分析数据表明miR-331-3p可能是其中的一个异常表达的miRNA。MicroRNA是有21-22个核苷酸组成的单链非编码小RNA，广泛存在于真核生物细胞中，通过与靶mRNA3’-非编码区域(3’-untranslatedregions3’-UTR)的互补配对在转录后水平对基因表达进行调控，导致mRNA的降解或翻译抑制(Bartel,2004；Calin&Croce2006)。MiRNA与靶mRNA分子组成了一个复杂的调控网络，参与包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、发育和逆境应答等多种复杂的调控网络(Gaal&Olah,2012；Linetal.,2013)。大量实验结果表明miRNA在人类癌症中普遍失调。MiRNA能够抑制涉及癌症发生发展的下游靶基因表达，从而作为致癌或者抑癌因子发挥作用(Zhangetal.,2007)。MiRNA表达失调可能是人类肿瘤发生的一个常见原因(Croce,2009)。HCC是一种常见的癌症，主要致病因素是慢性HBV感染。有文献报道病毒感染能够干扰细胞内miRNA的表达(Lin&Flemingtonetal.,2011)。大量的研究表明，HBV能够通过涉及的miRNAs方式在HCC中发挥促癌作用(Xuetal.,2013；Wangetal.,2011；Zouetal.,2014)。在之前的研究中报道过用基因芯片的方法研究miRNAs在HepG2和HepG2.2.15细胞中的差异性表达(Zhangetal.,2011)，从中，我们发现相对于对照细胞HepG2，miR-331-3p在HepG2.2.15细胞中呈上升的趋势。同样有文献报道过miR-331-3p在其他肿瘤中，例如：前列腺癌、胃癌、恶性胶质细胞瘤中发挥着重要的作用(Episetal.,2014；Episetal.,2012；Episetal.,2011；Guoetal.,2010)，但是miR-331-3p是否参与HCC发生发展以及miR-331-3p的作用有哪些还需要进一步的研究。VHL(vonHippel-Lindautumorsuppressor)综合征是一种显性遗传的家族继承性癌症综合征，能够诱发各种良性和恶性肿瘤。VHL基因的失活突变是造成VHL综合征家族性遗传的基础(Maher&Kaelin,1997)。VHL基因编码的蛋白质是包括转录延生因子B、转录延生因子C和cullin-2在内的蛋白复合物，并且具有泛素连接酶E3活性。此蛋白涉及缺氧诱导因子(hypoxia-induciblefactorHIF)的泛素化和降解(Cockman&Masson,2000)。VHL基因突变与许多肿瘤，例如嗜铬细胞瘤、肾透明细胞癌、中枢神经系统和视网膜的血管瘤等的形成相关，表明VHL基因可能在这些癌症中起到一个肿瘤抑制作用(Latifetal.,1993；Kim&Kaelin,2004)。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种用于抑制VHL基因表达的抑制剂及其制备。本专利技术的第一方面，首先公开了一种用于抑制VHL基因表达的抑制剂，为包含有miR-331-3p基因片段的表达载体，所述表达载体能够正确地表达miR-331-3p基因。较佳的，所述表达载体由pTARGET质粒改造获得，具体的，是在pTARGET质粒的多克隆位点区域中插入一段包含miR-331-3p基因片段的插入序列。较佳的，所述插入序列的插入位点为XhoI酶切位点和SalI酶切位点之间。较佳的，所述包含miR-331-3p基因片段的插入序列如SEQIDNO.1所示。1AACTTCATTTCTAAATCAAAGTATTTTCTGCACTTTTATTGCACCAATCTGTTACCTTCT61GTTCATACCATGACTTAAATAATGCTTACTCAGGCACAGTACTATCAGCTGACAACGTAC121AGAAGGCTCCAGAAATGTCACTCCCATCCCTTAAAGGTTGGTATATGGTCCTGGTACAGT181CGTGGAGGTCCATATGGGTGAAAAGCCCAGAAGTCTACCTGAGCTGAAAGCACTCCCAAG241GAGTTTGGTTTTGTTTGGGTTTGTTCTAGGTATGGTCCCAGGGATCCCAGATCAAACCAG301GCCCCTGGGCCTATCCTAGAACCAACCTAAGCTCGCGCATCATTCCTGGAACATCAAGAG361TGTGAAGACTGAAGATAACCTGAGGCCTACCAGACATCCTATATTCACCAAGATTCACAT421TTTTTGGTATGTGTGCCTACATTTTAGCAAAAATTGGTTGGTTAATCCTTCTAAAATTAG481AGGGATGACATTGGGTAACAAAGTCTTCCCAGCCTTTGGCATTATAGTAATTTCTCGCAA541TAGAAATTCCATACAGATATTATTGCCAGTGAAGAGAGCTATTCTTGTTTATTATCAGTT601CTATATTTTTAGCTGAAGCAACTTAGCCCTAAAA较佳的，所述抑制剂的序列如SEQNO.4所示。本专利技术第二方面，还进一步公开了前述抑制剂的制备方法：通过PCR的方法在所述包含miR-331-3p基因片段的插入序列两端添加酶切位点序列，采用酶切、连接的方法将所述miR-331-3p基因片段插入pTARGET质粒载体，筛选、鉴定连接正确的连接产物为本专利技术的抑制剂。较佳的，所述抑制剂适用于SMMC7721细胞等哺乳动物肝癌细胞系。本专利技术第三方面，提供了前述抑制剂用于抑制VHL基因表达的应用。本专利技术的抑制剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本专利技术的抑制剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本专利技术的抑制剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于抑制VHL基因表达的抑制剂，所述抑制剂为包含有miR‑331‑3p基因片段的表达载体。

【技术特征摘要】
1.miR-331-3p基因片段在制备用于抑制VHL基因的表达的抑制剂中...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤华，曹漪伊，
申请(专利权)人：重庆贝羿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85