一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定方法。本发明专利技术所提供的用于鉴定或辅助鉴定霍山石斛的引物对，具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。实验证明，采用本发明专利技术所提供的引物，通过快速PCR方法实现了霍山石斛与重唇石斛的快速、准确鉴别，实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定方法。
技术介绍
霍山石斛（Dendrobium huoshanense）是安徽省大别山区特有的、国家重点保护的名贵中草药，隶属于兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）。重唇石斛（Dendrobium hercoglossum）为霍山石斛的同属近缘种，两者形态特征比较相近，制成枫斗后两者不易通过外形进行鉴别，导致在市场上重唇石斛成为霍山石斛的混淆品之一。由于霍山石斛与重唇石斛通过外形鉴别比较困难，采用传统的鉴定方法有一定的局限。因此，亟需寻找一种快速、准确的鉴定方法，以确保霍山石斛药材鉴定的准确性。栗丹等利用DNA条形码ITS序列对霍山石斛及其近缘物种进行了鉴定（栗丹，李振坚，毛萍，严雪锋，淳泽，马欣荣，基于ITS序列石斛材料的鉴定及系统进化分析，园艺学报，2012，39（8）：1539），但该方法需要进行测序，耗时较长，且使用大型仪器，不利于实现快速、现场检测。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定霍山石斛的引物对。一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定的操作步骤如下：（1）提取待测样品的DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述引物对为：上游引物CP6s：5’-GCCCATAAATGGGTTTC-3’下游引物CP6a：5’-GCACATCCGAGCCTTA-3’；（2）琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物若PCR扩增产物中含有275 bp的DNA片段，则所述待测样品中含有霍山石斛；若PCR扩增产物中不含有275 bp的DNA片段，则所述待测样品为非霍山石斛。进一步限定的比对鉴定技术方案如下：步骤（1）PCR扩增反应中，PCR反应体系的总体积25 µL，其中0.5µL待测样品的DNA，1.0µL含量为10 pmol的上游引物CP6s，1.0µL含量为10 pmol的下游引物CP6a，2.5µL 10×buffer缓冲液，1.5µL浓度为25 mM的氯化镁（MgCl2）水溶液，0.5µL浓度为10 mM的dNTPs ，0.5µL浓度为5U/µL的 Taq DNA聚合酶，无菌双蒸水补足至25µL；PCR扩增反应条件： 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环；72 ℃ 10 min。步骤（2）的具体操作如下：取5µLPCR扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶，在电压80-90V下电泳30分钟，凝胶成像系统下观察并拍照；若PCR扩增产物中含有275 bp的DNA片段，则所述待测样品中含有霍山石斛；若PCR扩增产物中未含有275 bp的DNA片段，则所述待测样品为非霍山石斛。一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定的检测试剂盒，将PCR反应体系中的上游引物CP6s和下游引物CP6a分别单独包装；将除待测样品的DNA、上游引物CP6s和下游引物CP6a外的其它物质混合均匀单独包装；将以上分别单独包装的物质放置于同一个试剂盒内，组成一个检测试剂盒。进一步限定的检测试剂盒技术方案如下：根据进一步限定的比对鉴定操作技术方案所述的检测试剂盒，在每次检测时，需要从检测试剂盒中取用不同的物质，各种物质所取的量必须满足进一步限定的鉴定操作技术方案中PCR反应体系中各物质量的要求。实验证明，采用本专利技术所提供的引物，通过快速PCR方法实现了霍山石斛与重唇石斛之间的快速、准确鉴别，实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。附图说明图1为霍山石斛、重唇石斛及部分相似种的系统发育树。其中，谱系分支节点上方为BI树的后验概率PP和MP树的自举支持度BS，在斜线的左边为PP值，斜线的右边为BS值。图2为通用引物扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为2000、1000、750、500、250和100 bp）；1：霍山石斛；2：重唇石斛；3：：空白对照。图3为特异性PCR引物对SH-CP6（上下游引物分别为SH-CP6s和SH-CP6a）扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为2000、1000、750、500、250和100 bp）；1：用特异性PCR引物对SH-CP6扩增1个霍山石斛样本的结果；2：用特异性PCR引物对SH-CP6扩增1个重唇石斛的结果；3：空白对照。图4为特异性PCR引物对SH-CP6（上下游引物分别为SH-CP6s和SH-CP6a）扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为2000、1000、750、500、250和100 bp）；1到7：霍山石斛DNA模板浓度依次为143 ng/μl、71 ng/μl、36 ng/μl、18 ng/μl、9 ng/μl、4 ng/μl和2 ng/μl；8到14：重唇石斛DNA模板浓度依次为143 ng/μl、71 ng/μl、36 ng/μl、18 ng/μl、9 ng/μl、4 ng/μl和2 ng/μl。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、用于鉴定霍山石斛的试剂盒的制备及使用方法一、用于鉴定霍山石斛的引物对的设计与合成从GenBank查找或通过本研究进行测序获得霍山石斛及混淆品的ITS序列，详见下表1。其中，本研究测序所得单倍型序列（包括Hap5，Hap6和Hap7）详见序列表中序列4至序列6所示。表1霍山石斛、重唇石斛及部分相似种的ITS序列编号样品名称样品数量单倍型GenBank登录号本研究所得序列编号1铁皮石斛Dendrobium catenatum1Hap1KP7435432铁皮石斛Dendrobium catenatum1Hap2KF1434393金钗石斛Dendrobium nobile1Hap3EF6187324金钗石斛Dendrobium nobile1Hap4JN3885795河南石斛Dendrobium henanense1Hap5IHN1H6河南石斛Dendrobium henanense6Hap6IHN1C; IHN1E; IHN1F; IHN1G; HNITS01; IHN1D7霍山石斛Dendrobium huoshanense3Hap7KF143476IHS1A IHS2D8霍山石斛Dendrobium huoshanense1Hap8JN3885679重唇石斛Dendrobium hercoglossum1Hap9JN38857610重唇石斛Dendrobium hercoglossum1Hap10EU84069311美花石斛Dendrobium loddigesii1Hap11KF14348112美花石斛Dendrobium loddigesii1Hap12HQ11422013菱唇石斛Dendrobium leptocladum1Hap13AF52161214菱唇石斛Dendrobium leptocladum1Hap14EU840697分别用贝叶斯法（Bayesian inference, BI）本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定方法，其特征在于操作步骤如下：（1）提取待测样品的DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述引物对为：上游引物CP6s：5’‑GCCCATAAATGGGTTTC‑3’下游引物CP6a：5’‑GCACATCCGAGCCTTA‑3’；（2）琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物若PCR扩增产物中含有275 bp的DNA片段，则所述待测样品中含有霍山石斛；若PCR扩增产物中不含有275 bp的DNA片段，则所述待测样品为非霍山石斛。

【技术特征摘要】
1.一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定方法，其特征在于操作步骤如下：（1）提取待测样品的DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述引物对为：上游引物CP6s：5’-GCCCATAAATGGGTTTC-3’下游引物CP6a：5’-GCACATCCGAGCCTTA-3’；（2）琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物若PCR扩增产物中含有275 bp的DNA片段，则所述待测样品中含有霍山石斛；若PCR扩增产物中不含有275 bp的DNA片段，则所述待测样品为非霍山石斛。2.根据权利要求1所述用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定方法，其特征在于：步骤（1）PCR扩增反应中，PCR反应体系的总体积25 µL，其中0.5µL待测样品的DNA，1.0µL含量为10 pmol的上游引物CP6s，1.0µL含量为10 pmol的下游引物CP6a，2.5µL 10×buffer缓冲液，1.5µL浓度为25 mM的氯化镁（MgCl2）水溶液，0.5µL浓度为10 mM的dN...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵群，陈乃富，陈存武，韩邦兴，戴军，刘枫，
申请(专利权)人：皖西学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34