与胃癌相关的LncRNA标记物及其专用检测引物、检测方法、试剂盒与应用技术

本发明专利技术公开了一种与胃癌相关的LncRNA标记物及其专用检测引物、检测方法、试剂盒与应用。该LncRNA标记物命名为LINP1，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO.1所示，用于检测LINP1的引物，其上游引物(LINP1‑F)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.2所示，其下游引物(LINP1‑R)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.3所示。本发明专利技术提出的LINP1是与胃癌特别相关的长链非编码RNA，LINP1表达量可以从组织中被高特异性地检测出，检测操作简便，定量准确，有助于临床判断胃癌患者术后的复发率与预后效果的好坏，还能用于胃癌治疗药物的筛选，对于新药开发提供帮助。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种长链非编码RNA(LncRNA)标记物及其应用，特别是涉及一种与胃癌相关的LncRNA标记物及其专用检测引物、检测方法、试剂盒与应用。
技术介绍
胃癌是常见恶性肿瘤之一，全世界每年新发胃癌近一百万例，中国约占一半左右。胃癌的死亡率高居癌症相关死亡率的第三位，我国胃癌的年龄标准化的5年相对生存率只有27.4％，严重威胁人民健康。尽管近年来新辅助化疗等综合治疗模式取得了长足进展，但手术仍是胃癌最主要的治疗手段，但是，术后的复发和转移是影响患者生存的重要因素，是临床难题。因此，如果能尽早预测复发或转移，并采取必要的治疗干预措施，无疑会使患者生存获益。影响胃癌预后的因素很多，目前判断胃癌预后的主要方法还是传统的国际抗癌联盟(Tumor-Node-Metastasis，TNM)分期方法，以预估无复发生存时间。但在临床工作中，经典的TNM分期无法解释分期相同而预后差异明显的情况，而且不能对术后早期复发进行判断。目前，临床工作者正完善第八版胃癌TNM分期系统以评估预后。与此同时，基础研究人员也从肿瘤异质性方面来考虑，寻找新的判断预后的分子指标，作为TNM病理分期系统的补充。胃癌的发生、发展涉及癌基因和抑癌基因的突变，也涉及表观遗传等的改变。因此，对于胃癌诊断和预后有关的分子生物学标记物研究已成为研究重点。目前，胃癌肿瘤分子标记物的研究报告很多，除传统意义的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)等以外，目前研究热点分子标记物HER2等对胃癌预后判断也具有一定的意义，但是以上分子标记物多集中于对不同肿瘤分期的研究，以及淋巴结转移、浸润深度的影响，缺乏相同病理分期、同种术式及术后治疗方案而预后不同的分子标记物研究，缺乏特异性和灵敏度高的分子标记物来预测胃癌的发生、发展和预后。长链非编码RNA(LncRNA)是指长度大于200bp的核苷酸，具有基因表达调节功能的不能编码产生蛋白质的一类RNA。LncRNA参与了胃癌的发生、发展、侵袭和转移等生物学行为，其作用方式有表观遗传调控、转录水平调节和转录后水平调节。如能筛选出胃癌术后早期复发和预后特异或异常表达的LncRNA作为生物标记物，开发出相关试剂与试剂盒，能准确检测该LncRNA生物标记物的表达量，将对胃癌术后早期复发和预后的预测产生有力的推动。另外，异常表达的LncRNA能影响胃癌细胞的迁移与转移，有助于发现具有潜在治疗价值的小分子药物。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种提供与胃癌相关的LncRNA标记物。本专利技术所提供的与胃癌相关的LncRNA标记物，命名为LINP1，其与胃癌术后复发和预后特别相关，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO.1所示，或与序列表中SEQ ID NO：l所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并与胃癌术后复发和预后相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQ IDNO：l所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测该LncRNA标记物LINP1的引物。本专利技术所提供的用于检测标记物LINP1的引物，其上游引物(LINP1-F)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.2所示，其下游引物(LINP1-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.3所示。为方便检测，可将GAPDH作为内参，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO.4所示，用于检测GAPDH内参的引物，其上游引物(GAPDH-F)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.5所示，其下游引物(GAPDH-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.6所示。本专利技术的第三个目的是提供一种检测标记物LINP1表达量的试剂盒。本专利技术的所提供的检测标记物LINP1表达量的试剂盒，包括上述标记物LINP1的引物和用于检测GAPDH内参的引物。具体来讲，所述试剂盒包括以下用于20μL PCR反应体系的试剂：2×聚合酶链反应预混液(包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl2，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBR Green I)11μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，无RNA酶水7μL。本专利技术的第四个目的是提供一种非诊断用途的检测标记物LINP1表达量的方法。本专利技术所提供的检测标记物LINP1表达量的方法，可包括以下步骤：1)提取待测肿瘤组织和正常组织的总RNA，逆转录合成cDNA；2)以cDNA为模板，在引物LINP1-F和LINP1-R的引导下进行LncRNA标记物LINP1的实时荧光定量PCR检测，在引物GAPDH-F和GAPDH-R的引导下进行GAPDH内参的实时荧光定量PCR检测；3)采用相对定量法计算LncRNA标记物LINP1的表达量，计算公式为F＝2-ΔΔct，其中，ΔΔct＝(肿瘤组织中LINP1的ct平均值-肿瘤组织中GAPDH的ct平均值)-(对照正常组织中LINP1的ct平均值-对照正常组织中GAPDH的ct平均值)。在上述检测方法中，所述步骤2)的20μL PCR反应体系为：2×聚合酶链反应预混液(包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl2，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBR Green I)11μL，cDNA 1μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，无RNA酶水7μL；PCR反应条件为：先95℃30秒；然后95℃5秒，60℃30秒，共40个循环。以上所述引物LINP1-F和LINP1-R、所述引物GAPDH-F和GAPDH-R以及所述试剂盒在检测LncRNA标记物LINP1表达量中的应用也属于本
技术实现思路
。本专利技术与胃癌相关的LncRNA标记物LINP1和检测LINP1表达量的试剂盒能用于胃癌术后复发率和预后效果的判断，也可以用于胃癌治疗药物的筛选，非诊断目的的应用属于本
技术实现思路
。应用一为所述的LncRNA标记物LINP1在胃癌术后复发率和预后效果判断中的应用，该应用为检测LINP1表达量，以该表达量数值与一界值比较后做出复发率和预后效果判断，若LINP1表达量＜7.65，复发率高，预后差，若LINP1表达量＞7.65，复发率低，预后好。本专利技术不包括将LINP1的表达量作为是否患胃癌的直接判断指标的限定。应用二为所述的LncRNA标记物LINP1在筛选胃癌治疗药物中的应用，该应用为检测LINP1表达量，以该表达量数值与一界值比较后做出药物敏感评价，若LINP1表达量＜7.65，表明受体对该药物不敏感，该药物不被推荐；若LINP1表达量＞7.65，表明受体对该药物敏感，该药物被推荐。综上，本专利技术提供了一种与胃癌相关的LncRNA标记物及其专用检测引物、检测方法、试剂盒及应用。本专利技术具有以下优点：1)提出的LINP1是与胃癌特别相关的长链非编码RNA，LINP1表达量可以从组织中被高特异性地检测出，有助于临床判断胃癌患者术后的复发率与预后好坏。2)操作简便，定量准确。3)LINP1还能用于胃癌治疗药物(特别是小分子药物)的筛选，结合动物模型或临床数据用于评价受体对药物的敏感性，对于新药开发提供帮助。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。附图说明图1为与胃癌相关的Ln本文档来自技高网...

【技术保护点】
与胃癌相关的LncRNA标记物，命名为LINP1，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO.1所示，或与序列表中SEQ ID NO：l所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并与胃癌相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQ IDNO：l所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.与胃癌相关的LncRNA标记物，命名为LINP1，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO.1所示，或与序列表中SEQ ID NO：l所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并与胃癌相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQ IDNO：l所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。2.用于检测权利要求1所述的LncRNA标记物LINP1的引物，其上游引物(LINP1-F)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.2所示，其下游引物(LINP1-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.3所示。3.用于检测权利要求1所述的LncRNA标记物LINP1所用GAPDH内参的引物，其上游引物(GAPDH-F)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.5所示，其下游引物(GAPDH-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.6所示，所述GAPDH内参的核苷酸序列如序列表中SEQ NO.4所示。4.一种检测权利要求1所述的LncRNA标记物LINP1表达量的试剂盒，包括权利要求2所述的LncRNA标记物LINP1的引物和权利要求3所述的用于检测GAPDH内参的引物。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下用于20μL PCR反应体系的试剂：2×聚合酶链反应预混液(包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl2，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBR Green I)11μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，无RNA酶水7μL。6.一种非诊断目的检测权利要求1所述的LncRNA标记物LINP1表达量的方法，包括以下步骤：1)提取待测肿瘤组织和正常组织的总RNA，逆转录合成cDNA；2)以cDNA为模板，在权利要求2所述引物LINP1-F和LINP1-R的引导下进行LncRNA标记物LI...

【专利技术属性】
技术研发人员：张珂诚，郗洪庆，高云鹤，胡翀，卫勃，吴晓松，彭正，王宁，陈凛，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京;11