本发明专利技术公开了一种检测食品中志贺氏菌和整合子的引物、探针、试剂盒及方法，引物的序列为：上游引物SHGF：AAGACCAAAGAGGGGGACCT下游引物SHGR：TGTCTCAGTTCCAGTGTGGC所述整合子引物的序列为：上游引物int1F：CATCGTCGTAGAGACGTCGG下游引物Int1R：AGAACAAGCAGGCATCACGA。本发明专利技术的试剂盒内的引物、探针以及其它组分、配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重ddPCR检测食品中志贺氏菌及整合子int1；本发明专利技术检测方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测食品中及整合子int1的引物，以及与该引物配合使用的探针；本专利技术还涉及一种包含上述引物和探针的双重微滴式数字PCR检测试剂盒，本专利技术还涉及一种采用上述试剂盒检测食品中志贺氏菌及整合子int1的方法。
技术介绍
志贺氏菌Shigella，为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无牙孢。进食含有该菌的食物可致食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒。志贺氏菌广泛存在于各类生的或加工蔬菜，奶和奶制品，禽、肉制品、水果、面包制品，汉堡包等。志贺氏菌快速检测技术建立将提高食源性致病菌检测效率和检测通量，为不同条件的检测机构提供技术支持，满足食品中志贺氏菌快速检测要求，更好地保障食品安全，有利于国内外贸易发展，在食品卫生与食品安全检测方面具有重要意义。本专利技术旨在建立一种快速、准确检测动物源性食品中志贺氏菌方法，提高食源性志贺氏菌的检测效率，为动物源性食品致病微生物监测提供技术手段。1989年，Strokes首次提出整合子的概念，1991年Hall正式提出了基因盒－整合子系统的概念。整合子是细菌的DNA片段，与细菌耐药性密切相关，是一种存在于细菌质粒或染色体上的遗传元件系统，通过自身编码的整合酶来获取外源基因并使之表达。整合子捕获、整合和表达耐药性基因盒，引起耐药基因在同种或不同种菌属间传播，从而使细菌的耐药性得以广泛扩散。基因盒通过整合子上整合酶被整合到整合子中或从整合子里被剪切下来，使耐药基因得以传播与扩散。目前，已有130多种耐药基因盒被确认整合子通过位点特异性重组捕获并表达外源基因盒，从而赋予宿主菌对各种常用药物种类产生耐药性。同时整合子自身可位于接合性质粒、转座子等可移动性元件上，可使整个整合子发生移动。因而整合子在新的耐药菌株的出现及耐药基因水平播散中扮演着非常重要的角色。整合子根据整合酶蛋白的一级结构主要分为4类，但第1类整合子最常见。本专利技术通过设计针对志贺氏菌和整合子的特异引物、探针组合，可了解不同食品中志贺氏菌的分布和菌株中整合子的流行情况。目前，各类食品安全标准都要求对志贺氏菌的进行定量检测，但对于志贺氏菌的定量检测主要还是通过传统方法进行培养后计数。而常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且不可能实现定量检测。目前，Southern blot和实时荧光定量PCR是常用的两种外源基因拷贝数分析技术，已广泛用于外源基因拷贝数分析。但这两种方法也存在一定缺陷。例如，Southern blot方法分析时工作量大、周期长、操作要求高、准确性较差，特别是对于多拷贝基因的分析，结果容易偏小。qRT-PCR在分析外源基因拷贝数时必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，只是一种相对定量方法，且标准曲线的质量易受到DNA纯度、引物和探针的浓度、反应抑制因子等诸多因素影响；另外，标准曲线必须基于标准物质建立，而标准物质的种类有限和昂贵价格不能适用于所有的研究。微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近年来兴起的一种新的绝对定量技术，它基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的基因拷贝数。但基于微滴数字PCR平台的拷贝数的分析工作报道较少，针对志贺氏菌及整合子的检测就更未见报道了。本专利技术基于微滴式ddPCR平台，建立了志贺氏菌及其整合子基因拷贝数分析方法，研究结果为分析食品安全生物源性风险因子的定量检测提供了新的方法和借鉴，也为食品安全质量控制提供了一个技术支撑手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测食品中志贺氏菌及整合子int1的引物，以及与该引物配合使用的探针；本专利技术的另一个目的是提供一种包含上述引物和探针的试剂盒，该试剂盒内的引物、探针以及其它组分、配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重ddPCR检测食品中志贺氏菌及整合子int1；本专利技术另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测食品中志贺氏菌及整合子int1的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。为了达到上述目的，本专利技术采用以下方案：一种检测食品中志贺氏菌和整合子的引物，其特征在于包括有志贺氏菌引物和整合子引物；所述志贺氏菌引物的序列为：上游引物SHGF：AAGACCAAAGAGGGGGACCT下游引物SHGR：TGTCTCAGTTCCAGTGTGGC所述整合子引物的序列为：上游引物int1F：CATCGTCGTAGAGACGTCGG下游引物Int1R：AGAACAAGCAGGCATCACGA。本专利技术与如上所述引物配合使用的探针，其特征在于包括有志贺氏菌探针和整合子探针：所述志贺氏菌探针的序列为：探针SHGP：TAGCTGGTCTGAGAGGATGA所述整合子探针的序列为：探针Int1P：AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。本专利技术用于检测食品中志贺氏菌和整合子的试剂盒，其特征在于包含权利要求1中的引物和权利要求2中的探针。如上所述用于检测食品中志贺氏菌和整合子的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20.0μL反应体系包括以下组分：2×ddPCR Super Mix10.0μL，志贺氏菌和整合子int1的正反向引物各1.0μL、或/和志贺氏菌和整合子int1的探针各1.0μL，DNA模板4.0μL。用于检测食品中志贺氏菌及整合子的方法，其特征在于包括以下步骤：A、提取样品DNA；B、将各反应组分加入如权利要求4所述的20.0μl反应体系，然后加入70.0μl矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；同时分别取试剂盒中的阳性质控和阴性质控，制备相应的DNA模板；C、将数字PCR混合液ddPCR Super Mix制作成油包水PCR微反应体系，并全部转移到96孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板PCR反应管在封膜仪上封膜，并置于普通PCR仪进行PCR反应；D、打开微滴荧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板PCR反应管直接插入设备，检测每个96孔反应板PCR反应管中微滴的PCR反应情况，最后根据珀松分布定律算出待测基因的拷贝数。如上所述用于检测食品中志贺氏菌及整合子的方法，其特征在于步骤C中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性10s，59℃退火1min，共进行40个循环；(3)98℃酶热失活10min；(4)4℃停止反应。如上所述用于检测食品中志贺氏菌及整合子的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：取1.5mL培养物10000rpm离心2min；沉淀物加入500μL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μL 10％SDS，混匀，于37℃温育1h；加入100μL 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测食品中志贺氏菌和整合子的引物，其特征在于包括有志贺氏菌引物和整合子引物；所述志贺氏菌引物的序列为：上游引物SHGF：AAGACCAAAGAGGGGGACCT下游引物SHGR：TGTCTCAGTTCCAGTGTGGC所述整合子引物的序列为：上游引物int1F：CATCGTCGTAGAGACGTCGG下游引物Int1R：AGAACAAGCAGGCATCACGA。
【技术特征摘要】
1.一种检测食品中志贺氏菌和整合子的引物，其特征在于包括有志贺氏菌引物和整合子引物；所述志贺氏菌引物的序列为：上游引物SHGF：AAGACCAAAGAGGGGGACCT下游引物SHGR：TGTCTCAGTTCCAGTGTGGC所述整合子引物的序列为：上游引物int1F：CATCGTCGTAGAGACGTCGG下游引物Int1R：AGAACAAGCAGGCATCACGA。2.与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于包括有志贺氏菌探针和整合子探针：所述志贺氏菌探针的序列为：探针SHGP：TAGCTGGTCTGAGAGGATGA所述整合子探针的序列为：探针Int1P：AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。3.用于检测志贺氏菌和整合子的试剂盒，其特征在于包含权利要求1中的引物和权利要求2中的探针。4.根据权利要求3所述用于检测志贺氏菌和整合子的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20.0μL反应体系包括以下组分：2×ddPCR Super Mix10.0μL，志贺氏菌和整合子int1的正反向引物各1.0μL、或/和志贺氏菌和整合子int1的探针各1.0μL，DNA模板4.0μL。5.用于检测食品中志贺氏菌及整合子的方法，其特征在于包括以下步骤：A、提取样品DNA；B、将各反应组分加入如权利要求4所述的20.0μl反应体系，然后加入70.0μl矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；同时分别取试剂盒中的阳性质控和阴性质控，制备相应的DNA模板；C、将数字PCR混合液ddPCR Super Mix...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡先全，王勇，吴冰，李云松，李蓉，邱霞，张杰豪，萧崎倩，
申请(专利权)人：中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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