一种污泥中志贺氏菌的快速定量检测方法技术

一种污泥中志贺氏菌的快速定量检测方法，属于生物技术中病原菌检测技术领域。本发明专利技术依次包括以下步骤：（１）污泥样品的梯度稀释及前增菌培养；（２）选择性增菌培养；（３）ＤＮＡ提取；（４）ＰＣＲ扩增及扩增产物检测；（５）利用ＭＰＮ计数软件计算得出结果。本发明专利技术采用ＭＰＮ法和特异性ＰＣＲ检测相结合的方法，实现了污泥中志贺氏菌的快速定量检测，选择性增菌和特异性ＰＣＲ能避免其他微生物的干扰，提高检测的灵敏度和特异性。本发明专利技术还具有缩短检测时间、提高检测效率和增大检测样品量的优点。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种污泥中志贺氏菌的快速定量检测方法，其特征在于检测步骤如下：　（１）污泥样品的梯度稀释和前增菌培养：取城市剩余污泥样品混匀，称取３ｇ城市剩余污泥到盛有２７ｍＬ　ＧＮ增菌液的５０ｍＬ的离心管中，涡旋震荡５－１０ｍｉｎ，混合均匀得泥水混合物；取０．５ｍＬ　ＧＮ增菌液稀释混匀的泥水混合物加入到经过灭菌的４．５ｍＬ　ＧＮ增菌液中得到各个稀释梯度，设５－７个稀释度；采用三管或者五管平行法，每个稀释度设３－５个重复样，于３７℃培养１８－２４ｈ，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液；（２）选择性增菌培养：移取步骤（１）所得各管中菌液０．５ｍＬ加入到志贺氏菌增菌肉汤中，３７℃培养１８－２４ｈ；（３）ＤＮＡ提取：移取步骤（２）所得各管中菌液２ｍＬ加入到１０ｍＬ离心管中，１００００ｇ离心３　ｍｉｎ，弃去上清液；再加入１ｍＬ无菌ＰＢＳ缓冲液，轻轻吹打均匀，１００００ｇ离心３　ｍｉｎ，弃去上清液；加入１０μＬ超纯水，液氮冷冻和沸水浴反复冻融３次，然后１００００ｇ离心３ｍｉｎ取上清液，完成ＤＮＡ提取；提取后的ＤＮＡ短时间内４℃保存，长时间－２０℃保存；（４）ＰＣＲ扩增及扩增产物检测：ＰＣＲ为５０μＬ反应体系：取步骤（３）所得ＤＮＡ　模板１μＬ，含ＭｇＣｌ↓［２］的１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ　４．０μＬ，均为２０ｍｍｏｌ／Ｌ的引物Ｐ１、Ｐ２各０．５μＬ，５Ｕ／μＬ的ｒＴａｑ酶０．２５μＬ，加入灭菌双蒸水至５０μＬ；ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ、５５℃退火３０ｓ、７２℃延伸１ｍｉｎ，经３０个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ；延伸后的扩增产物用１．２％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统进行拍照，产生特异性扩增条带的即为阳性，不产生特异性条带的即为阴性；所述特异性引物为：Ｐ１：５’－ＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＧＴＧＣ－３’；Ｐ２：５’－ＣＴＣＡＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣ－３’；（５）用ＭＰＮ计数软件计算结果：根据凝胶成像系统拍照结果，确定最大或然数ＭＰＮ结果，用ＭＰＮ　Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ软件计算得出污泥中最大可能的志贺氏菌含量。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘和，符波，王燕，陈燕，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]