对鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原特异的核苷酸及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种对鲍氏志贺氏菌１３型（Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１３）的Ｏ－抗原特异的核苷酸，它是鲍氏志贺氏菌１３型中控制Ｏ－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列。还包括Ｏ－抗原基因簇的结构以及源于鲍氏志贺氏菌１３型的Ｏ－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因（包括ｗｚｘ基因或与ｗｚｘ有相似功能的基因、ｗｚｙ基因或与ｗｚｙ有相似功能的基因）的寡核苷酸，并且包括获得细菌Ｏ－抗原基因簇的方法。本发明专利技术通过ＰＣＲ证实寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌１３型的Ｏ－抗原有高度的特异性。本发明专利技术还公开了用本发明专利技术的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的鲍氏志贺氏菌１３型的方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及鲍氏志贺氏菌13型(Shigella bodyii 13)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及鲍氏志贺氏菌13型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的鲍氏志贺氏菌13型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。因为O-抗原是极强的抗原，是志贺氏菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测志贺氏菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。志贺氏菌有46种血清型，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，二者亲缘关系非常近，并且有12种O-抗原是大肠杆菌和志贺氏菌共有的，传统的血清学方法不能将它们区分。本专利技术的次一目的是提供了鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。本专利技术的另一个目的是提供了构成鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原基因簇的基因转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf4、orf5、orf6、wbjE、orf11、orf12基因；糖合成路径基因，包括wbjB、wbjC、wbjD。本专利技术的又一个目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf4、orf5、orf6、wbjE、orf11、orf12基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因、源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原也是高度特异的。本专利技术的再一个目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原及检测和鉴定鲍氏志贺氏菌13型。本专利技术的还一个目的是提供了分离鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的。本专利技术对鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长14504个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。前述的对鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原特异的核苷酸，其由12个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。前述的对鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf4、orf5、orf6、wbjE、orf11、orf12基因；其中所述的基因wzx是SEQ ID NO1中的1695至3032碱基的核苷酸；wz y是SEQ ID NO1中的3019至4197碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO1中的4184至4969碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的4972至6042碱基的核苷酸；orf6是SEQ ID NO1中的6138至7172碱基的核苷酸；wbjE是SEQ ID NO1中的10193至11410碱基的核苷酸；orf11是SEQ ID NO1中的11412至11930碱基的核苷酸；orf12是SEQID NO1中的11935至13056碱基的核苷酸。前述的对鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原特异的核苷酸，其中源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf4、orf5、orf6、wbjE、orf11、orf12基因；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。前述的对鲍氏志贺氏菌13型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的2012至2030碱基的核苷酸和2931至2949碱基的核苷酸SEQ ID NO1中的1887至1904碱基的核苷酸和2599至2616碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2009至2026碱基的核苷酸和2493至2510碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对鲍氏志贺氏菌１３型的Ｏ－抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的分离的核苷酸，全长１４５０４个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的核苷酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，杨静华，冯露，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]