快速联检试剂盒制造技术

本实用新型专利技术涉及一种快速联检试剂盒，包括底板、上盖，底板内表面有测试带，上盖有观测窗，底板盖入上盖后组成试剂盒，其特征是：当底板盖入上盖后，测试带的一端裸露出试剂盒一侧。本试剂盒操作简便，不需要加样器械，检测样品时，直接将试剂盒一端浸入送检样品的提取液中，５秒内取出平放，５－１０分钟后就可以通过肉眼观测窗直接观察到检测结果。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种快速联检试剂盒。技术背景在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要 对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。有时还需要同时对几种外源性基因进行检 测。例如需要同时进行G2-EPSPS(5-烯醇丙酮莾草酸-3-磷酸合酶)蛋白编码基因(aroA) 和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)两种基因的检测。现有的检测装置，如酶免、放免等方法的装置，受仪器(酶标仪、放免闪烁仪、离心 机等)、场地等因素的限制，而且检测时间长，检测成本较高，很难推广应用。中国专利200520114588. X提供了一种联检EPSPS和BT蛋白的试剂盒，将送检物 品的提取液用分别滴加在试剂盒的两个加样孔中即可得到结果，虽然比起上述装置操作简 便、快速。但试剂盒的包装中还需要加样器或滴管等加样器械
技术实现思路
本技术的目的是建立一种操作更加简便、快速，不使用加样器即可进行快捷 检测转基因成分的联检试剂盒。本技术的技术方案是这样的—种快速联检试剂盒，包括底板、上盖，底板内表面有测试带，上盖有观测窗，底板 盖入上盖后组成试剂盒，其特征是当底板盖入上盖后，测试带的一端裸露出试剂盒一侧。当需要同时检测两种或多种转基因成分时，在底板内可置入多条不同的测试带， 且上盖设置相应数量的观测窗。底板的厚度不限，底板的上表面可以设置两条或多条可嵌入测试带凹槽，每个凹 槽可放置一条测试带。所述底板或上盖可具有卡槽，以保证底板与上盖扣紧。所述观测窗优选是长方形。试剂盒的形状是扁平的长方形盒。使用时，直接将裸露出试剂盒一端的测试带浸入待测样品液体，通过试剂盒上盖 的观测窗可直接观察到检测结果，每个观测窗可分别检查一种基因。本技术所述试剂盒的主要优点在于更方便快捷，无需加样器械，检测结果直观不借助任何仪器，用肉眼可观察到结果；应用广泛可检测玉米、棉花、水稻、小麦、烟草、大豆等各类农作物的叶片、种子及加工产品。由于本技术提供的联检试剂盒检测快速，特别适用于转基因产品的研制开发 和转基因产品的快速筛选，可用于实验室、田间、边防、海关植物检验、检验检疫局、食品安 全检测及种子经营销售等部门对可疑样本现场、快速筛查。以下结合附图和实施例，进一步举例说明本技术的
技术实现思路
。附图说明图1和图2是本技术一种联检试剂盒的结构示意图，其中图1是底板的俯视 图，底板有两条测试带；图2是试剂盒上盖的俯视图，上盖有两个观测窗；图中，1是测试带，2是观测窗，T是测试区，C是质控区。具体实施方式实施例1 一种联检试BT-CrylAh的试剂盒本试剂盒底板内表面置入两条不同的测试带(1)，上盖设置两个观测窗(2)。每个 观测窗分为测试区(T)和质控区(C)两部分，可在上盖上用字母C、T标示出；所述底板内的两条测试带，一条用于检测G2-EPSPS，另一条用于检测BT蛋白。所 述测试带是一种具有检测系统主体膜反应体系功能的检测材料，由高分子纤维膜、塑料等 多层材料制成。两种蛋白的测试带均可分为质控区和检测区，质控区可包被羊抗鼠IgG或 兔抗鼠IgG多克隆抗体；G2-EPSPS蛋白测试带的样品检测区包被特异功能性G2-EPSPS，BT 蛋白测试带的样品检测区包被BT-Cry lAh的单克隆抗体或多克隆抗体。当外源基因转入植物，并在植物中表达，将产生目的蛋白(G2-EPSPS和 BT-CrylAh)，因此通过检测样品中是否含有上述两种蛋白来确定该基因是否存在。如果外 源基因转入植物，发生基因沉默，无目的蛋白产生，将不能达到预期目的(抗除草剂或杀 虫)。检测时，只需将试剂盒梳状装置浸入送检物品的提取液中，5秒内取出试剂盒平 放，5-10分钟后，肉眼就可以通过观测窗直接观察到准确的检测结果。试剂盒的详细制备方法如下(一 )制备测试带l.BT-CrylAh单抗腹水的制备小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5mL。1周后，将BT-CrylAh单抗杂交瘤细胞注射于以上 预先处理过的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射杂交瘤细胞1 3X 106。10天后收获腹水， 以上过程皆在无菌条件下完成。2. BT-CrylAh单克隆抗体的纯化1)以DEAE离子交换层析及S印hacryl S 300分子筛对单抗进行纯化；SDS-PAGE 平板电泳检测纯化单抗的纯度；ELISA法测定单抗活性；2)纯化过程取小鼠单抗腹水一3，000 X g离心15分钟一上清液加50 %硫酸铵沉 淀，过夜一3，000 X g离心20分钟一沉淀溶于0. 01M磷酸盐缓冲液(pH 7. 2) — S-300凝胶 柱一DEAE Blue层析柱一0-800mM NaCl梯度洗脱一超滤离心，浓缩单抗；3)单抗纯度测定常规SDS-PAGE电泳，上述方法所纯化的单抗的纯度皆在95%以 上；4)蛋白浓度测定紫外分光光度计测定279nm处的0. D.值，按以下公式计算蛋白 含量0D279/1.4 = mg/mL (纯化单抗)。将单抗浓度调节为约lmg/mL ；5)单抗活性测定选用BT-CrylAh抗原包被ELISA板(lyg/孔)，及羊抗鼠 IgG-HRP复合物，测定各单抗效价(大于1 5000)。3.羊抗D0At高效价免疫抗血清的制备和纯化1)纯化好的上述单抗+完全佐剂一免疫山羊一加强免疫二次，每次间隔一月一第 二次加强后10天左右取血一离心取血清一硫酸铵沉淀一DEAE离子交换层析纯化；2)效价测定ELISA夹心法，抗体效价稀释度应大于1 256;3)蛋白浓度测定紫外分光法测定0D279，计算蛋白浓度。4.胶体金及金标抗体制备1)胶体金的制备以柠檬酸盐还原法制备40-60nm的胶体金。将0. 01 % HauCl4 加热至沸，加入一定量的柠檬酸三钠(Na3C6H507 *2H20)，继续加热煮沸5分钟，待胶体金 溶液颜色由兰一紫一红，稳定后，冷却即可。胶体金溶液应清亮透明，如需长期保存，可加入 0. 02% NaN3。2)将胶体金液500mL用0. 1M NaOH调pH8. 4，磁力搅拌下缓慢加入单抗2mL，搅拌 20分钟。5，500Xg离心30Min，除去上清液中未结合的蛋白质。离心后吸取胶体金标记抗 体沉淀，沉淀溶于10mL保存液中，用0. 45 y m微孔滤膜过滤。取样进行检定，其余置4°C保存。5.膜反应体系Ml的制备1)将BT-CrylAh抗体及纯化的羊抗鼠IgG以0. 1M磷酸盐缓冲液稀释，终浓度为约 0. 2-2mg/mL。2)纯化的羊抗鼠IgG溶于0. 1M磷酸盐缓冲液中，浓度为2. Omg/mL ；3)硝酸纤维素膜大小10cmX 27cm，每张膜可喷长25cm的检测及控制带各4条；4)将以上两种溶液分别加入Biodot XYZ3000喷涂机的二个喷头储存瓶中；5)设置喷速为2 u l/cm,NC膜的移行速度为50mm/s。以单抗BT_CrylAhAD2 (2mg/ mL)在NC膜上包被反应检测线，以1. 0mg/mL兔抗鼠IgG包被反应对照线，对照线与检测线 的距离为4-4. 5mm ；6)完成包被后，置37°C干燥箱24小时，用BB封闭液封闭处理半小时，用WB洗液 抽洗一次；7) 37 °C干燥箱干燥备用；8)切制备好的硝酸纤维素本文档来自技高网...

【技术保护点】
快速联检试剂盒，包括底板、上盖，底板内表面有测试带，上盖有观测窗，底板盖入上盖后组成试剂盒，其特征是：当底板盖入上盖后，测试带的一端裸露出试剂盒一侧。

【技术特征摘要】
快速联检试剂盒，包括底板、上盖，底板内表面有测试带，上盖有观测窗，底板盖入上盖后组成试剂盒，其特征是当底板盖入上盖后，测试带的一端裸露出试剂盒一侧。2.根据权利要求1所述的快速联检试剂盒，所述测试带数量是两条或两条以上；所述 观测窗数量是两个或两个以上。3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张维，郑建，李亮，刘奇，陆伟，林敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：实用新型
国别省市：11[中国|北京]