本发明专利技术公开了一种检测Ｄｋｋ－１的时间分辨荧光免疫分析方法及其试剂盒。该方法包括下列步骤：①固相抗体制备；②铕离子标记抗体制备；③测定方法：基于双抗体夹心的免疫反应。本发明专利技术检测Ｄｋｋ－１具有较高的灵敏度、特异度及稳定性；且分析系统高度自动化，可提高临床检验结果的速度，又可大幅度降低人为误差和增加检出结果的可靠性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种分泌型蛋白dickkopf l(Dkk-l)的免疫检测方法，特别涉 及一种检测Dkk-l的时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)及相应的试剂盒。
技术介绍
Wnt信号途径是对控制胚胎发育有重要作用的、进化上保守的信号转导 途径，其不恰当的激活参与了人类多种肿瘤的发生。最近的一些研究报道了 参与这一信号途径的细胞内分子P-catenin、 APC和AXIN的基因突变使细胞内P-catenin磷酸化水平降低和相应的泛素化降解削弱，致使稳定的P-catenin 入核与TCF / LEF结合调控相关基因的表达，因而导致wnt信号途径的异常 激活。分泌型蛋白dickkopf l(Dkk-l)在非洲爪蟾早期发育中发挥重要调控作 用，抑制wnt诱导的轴的复制而参与头的形成。Dkk-l人类的同源物也作为 一种抑制信号对Wnt信号途径起调控作用。目前的研究认为Dkk-l与低密度 月旨蛋白受体相关蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6， LRP 5/6)结合，在膜蛋白Kremen参与下引起LRP 5/6的内吞而抑制wnt信号。 最近有研究通过cDNA微阵列芯片技术比较肝细胞癌组织及邻近正常 肝组织的基因表达差异，发现Dkk-l基因在肝细胞癌中高表达，该基因编码 一个35kDa的分泌性蛋白^Dkk-l蛋白，以前对于该基因功能研究主要集 中在胚胎期神经的发育。随后我们分别采用RT-PCR、 Northern blot、荧光定 量PCR、 Western blot等技术均证实Dkk-l在人类多种肿瘤细胞系中有不同 程度高表达。在今年3月出版的Cancer Research杂志上，日本学者Takumi Yamabuki等报道了 Dkk-l在肺癌和食道癌中的诊断作用，Dkk-l在非小细胞 性肺癌的阳性率达70%,在小细胞性肺癌中的阳性率为69.4%，在食道癌中 为63%，仅有4.8%的假阳性率。血清Dkk-l蛋白检测，各室验均运用ELISA 原理自己建立检测方法，无商业化的试剂盒可用。ELISA方法存在稳定性差， 批间差异大，灵敏度低的缺点，难以满足Dkk-l检测。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏度、特异度及稳定性较佳，且 适于产业化的检测Dkk-l的时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)及其试剂为提高Dkk-l检测方法的灵敏度、特异度和/或稳定性，且能产业化利 用，本专利技术人在现有诸多免疫方法中进行筛选，惊奇地发现TRFIA在灵敏 度、特异度和稳定性方面均具有良好的效果。TRFIA是上世纪八十年代初发 展起来的新的免疫测定技术。其原理是利用具有双功能基团结构的螯和剂， 其一端和镧系元素，如铕(Eu)、铽(Te)、钐(Sm)、镝(Dy)等结合， 另一端和抗体分子上的自由氨基联接，制成镧系元素标记抗体，它与待测样 品中的抗原结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素，如 Ei^+的荧光强度就能确定样品中抗原的量，但实际上这种复合物的荧光强度 相当弱，只有再加入一种增强液(Enhancement solution),使镧系元素从复 合物中解离下来，并与增强液中所含的P-萘甲酰三氟丙酮(P-NTA)重新形 成微胶囊，在紫外等光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用全 自动TRFIA检测仪测定其荧光强度，即可确定样品中抗体的量，因此本发 明采用TRFIA检测Dkk-l可提高临床检验结果的速度，又可大幅度降低人 为误差，适于产业化检测。可见，本专利技术可以通过下列技术方案解决上述问题。 一种检测Dkk-l的 时间分辨荧光免疫分析方法，其可以包括下列步骤①固相抗体制备将抗Dkk-l单克隆抗体用缓冲液稀释至1 10mg/L作 为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭； ② 铕离子标记抗体制备选用抗Dkk-l多克隆抗体进行El^+标记，抗Dkk-l多克隆抗体与Eu,示记物Eu3+-DTTA的重量比为l:0.2 0.5;③ 测定方法测定的基础是基于双抗体夹心的免疫反应，包括在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔依次加入Dkk-l标准品或待测样品，加入反应缓冲液室温振荡反应，洗涤液洗涤后加入用反应缓冲液以体积比为1: 100稀释的步骤②制得的标记抗体100-200ul;室温振荡反应后用洗涤液洗涤，最后加入增强液进行荧光检测。其中，步骤①中所述的缓冲液优选50mmol/L、pH 9.6的Na2COrNaHC03 缓冲液，包被过程包括在96或48孔微孔板中加入100|al包被液，4t:放置 过夜，弃去包被液，用洗涤液冲洗4次，加200ial含0.2w/v。/。明胶和2w/vM 蔗糖的50mmol/L、 pH7.2的Tris-HCl缓冲液封闭，4"C放置过夜，弃去封闭 液，真空抽干。如不立即使用，可将其密封后置-20。C冷冻保存。根据本专利技术，步骤②铕离子标记方法可参照E^+标记试剂盒说明书。其 中抗Dkk-l多克隆抗体与Eu"示记物Eu3+-DTTA的重量比本专利技术优选 1:0.2 0.5，这样可获得标记率在7-8的最住标记效果(抗体/￡113+-011八，摩 尔比)。标记率太高，影响被标记抗体的免疫活性；标记率太低，信号强度 不够，降低检测灵敏度。较佳地，步骤③中所述的反应缓冲液为含有8mmol/LNaCl、 0.1w/v。/。明 胶、0.2 w/v°/。IgG、 50)utmol/L 二乙烯三胺五乙酸、O.lml/L Tween-80和 0.1w/v%NaN3的50mmol/L、 pH7.2的Tris-HCl缓冲液。而步骤(D中所述的洗涤液优选含有14.5mmol/LNaCl、 0.2ml/L Tween-80 和0.2 w/v%NaN3的50mmol/L、 pH7.2的Tris-HCl缓冲液。根据本专利技术，所述的Dkk-l标准品浓度分别为Ong/ml， 12.5ng/ml， 25 ng/ml， 50ng/ml， 100ng/ml， 500ng/ml。根据本专利技术，所述的Dkk-l待测样品通常是体液，如血清以及心包积液、 胸腔积液、腹腔积液、尿液等。本专利技术检测方法的基础是双抗体夹心的免疫反应同现有其它标记免疫 反应相似，铕标记抗体、Dkk-l抗原和反应板上的固化抗体经过振荡反应形 成夹心复合物，反应后经洗涤去除游离的未与固化抗体反应的Dkk-l、铕标记的Dkk-l抗体和/或Dkk-l与铕标记抗体形成的复合物。加增强液振荡反应后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪器测定其荧光强度。荧光强度与样品中的Dkk-l浓度成正比，对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。本专利技术要解决的另一技术问题是提供一种相应于上述TRFIA检测 Dkk-l的试剂盒。该检测Dkk-l的TRFIA试剂盒包括包被抗Dkk-l单克隆 抗体的固相抗体微孔板、反应缓冲液、洗涤液、Eu"标记的抗Dkk-l多克隆 抗体、增强液和Dkk-l标准品。其中，所述的包被抗Dkk-l单克隆抗体的固相抗体微孔板如上述步骤 ①。而所述的反应缓冲液、洗涤液也同上述。所述的增强液可选用现已知的E^+增强液含有15iLmiol/L P-萘甲酰三 氟丙酮、50pmol/L三正辛基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测Ｄｋｋ－１的时间分辨荧光免疫分析方法，其包括下列步骤： ①固相抗体制备：将抗Ｄｋｋ－１单克隆抗体用缓冲液稀释至１～１０ｍｇ／Ｌ作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭。 ②铕离子标记抗体制备：选用抗Ｄｋｋ－１多克隆抗体进行Ｅｕ↑［３＋］标记，抗Ｄｋｋ－１多克隆抗体与Ｅｕ↑［３＋］标记物Ｅｕ↑［３＋］－ＤＴＴＡ的重量比为１∶０．２～０．５。 ③测定方法：在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔依次加入Ｄｋｋ－１标准品或待测样品，加入反应缓冲液室温振荡反应，洗涤液洗涤后加入用反应缓冲液以体积比为１∶１００稀释的步骤②制得的标记抗体１００－２００ｕｌ；室温振荡反应后用洗涤液洗涤，最后加入增强液进行荧光检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：盛世乐，黄钢，谢秀兰，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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