弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤分子病理分型方法及试剂盒和应用技术

本发明专利技术公开一种弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤分子病理分型方法，将三种不同波长的量子点标记物作为荧光探针，检测生物样品中ＣＤ１０、Ｂｃｌ－６和ＭＵＭ１蛋白的表达。本发明专利技术还公开了用于弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤分子病理分型的试剂盒及其应用。本发明专利技术弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤分子病理分型方法，显著提高了工作效率，且对弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤患者采取合理的治疗方案，有利于节省医疗费用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及血液肿瘤学和医学领域，尤其涉及弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分 型方法及试剂盒和应用。
技术介绍
弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常见的非 霍奇金淋巴瘤，约占每年初发非霍奇金淋巴瘤的40%左右。我国目前非霍奇金淋巴瘤的发 病率约为3-4/10万，并以每年2-3%的速度增长，其中弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)最为 常见，约占每年所有淋巴瘤的50%，因此，每年全国新发病例约为2-3万。DLBCL具有显著的生物学异质性，病人对治疗的反应差异显著，常规的CHOP联合 化疗方案(环磷酰氨、阿霉素、长春新碱和泼泥松)只能使约40%的患者获得长期缓解。随 着人-鼠嵌合性抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗，Rituximab)联合化疗(R-CHOP)的应用， 进一步提高DLBCL的临床疗效，但仍有30-40%的患者对治疗无效或治疗后迅速复发，疾病 进展快，预后差。因此，加强DLBCL生物学特性的研究，制定相应的治疗方案成为目前DLBCL 的研究热点。当前临床对DLBCL进行危险分层，主要是通过国际预后指数(International Prognostic Index, IPI)，包括年龄，体力状态，临床Ann Arbor分期，节外病灶数目，乳酸 脱氢酶水平。由于这种评价只是临床参数的组合，不能反映肿瘤发生过程中内在的分子生 物学异质性，因此对于相当一部分病例的预后不能进行准确评价，一些被分在低危、低中危 组的病人5年生存率仍仅有32%。基因芯片技术的应用为阐明DLBCL潜在的生物学异质性提供了一个高通量平台， 通过DLBCL基因表达谱分析，鉴别出了三种DLBCL亚型，提示肿瘤性B细胞处在不同的分 化阶段一种称为生发中心 B 细胞样 DLBCL(germinal center B cell-like DLBCL, GCB)， 此亚型因与正常生发中心B细胞表达的基因标志相同而得名；另一种亚型称为活化B细 胞样DLBCL (activated B cell-like DLBCL，ABC)，此亚型表达的基因型与促有丝分裂刺 激后外周血B细胞相似，GCB与ABC之间有数千基因表达差异。除以上两型之外，仍有 17% -40%的DLBCL无法用细胞起源来分型，被统称为3型(type3)，ABC和type3统称为非 GCB(non-GCB)。DLBCL亚型是独立于IPI的预后评价指标，各亚型对传统的联合化疗CHOP 方案的反应性和疗效各不相同，ABC和GCB的五年生存率分别为31%和59%，GCB的生存率 明显好于ABC，而3型本身具有异质性，无确定的生存率，但其总体预后情况与ABC亚型相 似。通过20例弥漫大B细胞淋巴瘤基因芯片表达谱分析，检测到一些与弥漫大B细 胞淋巴瘤分子病理分型及预后相关的特定基因，如Bcl-2，Bcl-6, CCND2, MYC, SCYA3，FNl, FOXP1, PKC-β，HGAL，⑶10，和MUMl等等。从中筛选出三个代表着B细胞分化不同阶段的 基因⑶10，Bcl-6和MUM1，其中⑶10和Bcl_6为生发中心B细胞标志，而MUMl为后生发中 心B细胞标志。基因芯片技术加深了对DLBCL生物学特性的理解，但因其对标本的要求较高(新鲜标本、适宜的冷冻保存等)、操作复杂、且基因芯片检测代价较高，故制约了 其临床实用性。申请号为200710173600.8的专利技术专利申请是利用普通免疫组织化学 (immunohistochemistry, IHC)的方法，对 DLBCL 标本进行 CD10、Bcl_6 和 MUMl 蛋白的表达 情况检测，并通过结果分析对弥漫大B细胞淋巴瘤进行分子病理分型。但是，这种常规免疫 组化的方法基本上是通过显色的手段来进行结果判断，三种指标的检测就意味着同一个样 本最少需要三张切片，每张切片进行一次免疫组化实验，然后对三张切片的结果分别进行 判读。整个过程存在很多重复步骤，操作繁琐、效率低。
技术实现思路
本专利技术要解决普通免疫组化方法对弥漫性大B细胞淋巴瘤进行分子病理分型时 操作繁琐、效率低的技术问题，提供一种结合量子点技术的弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病 理分型方法，显著提高了实验的工作效率。此外，还需要提供一种弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型的试剂盒及其应用。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现在本专利技术的一个方面，提供了一种弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型方法，包 括以下步骤将三种不同波长的量子点标记物作为荧光探针，检测生物样品中⑶10、Bcl-6和 MUMl蛋白的表达；依据检测结果进行分子病理分型，若CDlO (+)、或CDlO (_)/Bcl-6 (+)/MUMl (_)， 则表明该弥漫性大B细胞淋巴瘤为GCB型；若CDlO (-)/Bcl-6 (-)、或CDlO (-)/Bcl-6 (+)/ MUMl (+)，则表明该弥漫性大B细胞淋巴瘤为非GCB型。所述三种不同波长的量子点标记物，用于分别标记生物样品中⑶10、Bcl-6和 MUMl蛋白，使得在同一张切片上能同时检测该三种蛋白。优选的，所述检测通过免疫组织化学或组织芯片的方法实现。优选的，免疫组织化学所用的三种单克隆抗体，其至少包括两种不同种属来源，即 在选择该三种单克隆抗体时，至少选用两种种属来源的单克隆抗体进行组合，例如三种单 克隆抗体两种鼠源、一种兔源。在本专利技术的另一方面，还提供了一种用于弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型的 试剂盒，所述试剂盒包含针对CDlO蛋白的特异性抗体及量子点标记物；针对Bcl-6蛋白的特异性抗体及量子点标记物；针对MUMl蛋白的特异性抗体及量子点标记物。优选的，所述针对CDlO蛋白、Bcl-6蛋白和MUMl蛋白的量子点具有不同的波长， 适于在同一张切片上同时检测该三种蛋白。所述试剂盒采用免疫组织化学或组织芯片的方法对生物样品进行检测。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述试剂盒的应用，用于指导医生对弥漫性 大B细胞淋巴瘤患者选择适宜的治疗方案，当试剂盒的检测结果是CDlO (+)、或CDlO (_)/Bcl-6 (+)/MUMl (-)时，表明该弥漫 性大B细胞淋巴瘤为GCB型，宜对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者采用CHOP方案治疗；当试剂盒的检测结果是CDlO㈠/Bcl-6㈠、或CDlO㈠/Bcl_6⑴/MUMl (+)时，表 明该弥漫性大B细胞淋巴瘤为非GCB型，宜对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者采用R-CHOP方案 治疗。采取上述治疗方案的选择，是因为在以往研究中发现，弥漫性大B细胞淋巴瘤患 者采用传统CHOP方案，GCB型患者预后明显优于非GCB型患者；采用R-CHOP方案治疗，GCB 型患者与非GCB型患者预后无明显差异；GCB型患者采用CHOP方案治疗与采用R-CHOP方 案治疗预后无明显差异。因此，采用传统的CHOP方案，GCB型患者预后优于非GCB型患者； 利妥昔单抗(Rituximab)联合化疗(R-CH0P方案)可以使非GCB型患者受益，而并不能提 高GCB型患者的疗效。利妥昔单抗每个疗程治疗费用为10-15万元，对于国内大部分患者来说是沉重经 济负担。利用本专利技术试剂盒对弥漫性大B细胞淋巴瘤患本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤分子病理分型方法，其特征在于，包括以下步骤：　　将三种不同波长的量子点标记物作为荧光探针，检测生物样品中ＣＤ１０、Ｂｃｌ－６和ＭＵＭ１蛋白的表达；　　依据检测结果进行分子病理分型，若ＣＤ１０（＋）、或ＣＤ１０（－）／Ｂｃｌ－６（＋）／ＭＵＭ１（－），则表明该弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤为ＧＣＢ型；若ＣＤ１０（－）／Ｂｃｌ－６（－）、或ＣＤ１０（－）／Ｂｃｌ－６（＋）／ＭＵＭ１（＋），则表明该弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤为非ＧＣＢ型。

【技术特征摘要】
一种弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型方法，其特征在于，包括以下步骤将三种不同波长的量子点标记物作为荧光探针，检测生物样品中CD10、Bcl 6和MUM1蛋白的表达；依据检测结果进行分子病理分型，若CD10(+)、或CD10( )/Bcl 6(+)/MUM1( )，则表明该弥漫性大B细胞淋巴瘤为GCB型；若CD10( )/Bcl 6( )、或CD10( )/Bcl 6(+)/MUM1(+)，则表明该弥漫性大B细胞淋巴瘤为非GCB型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测通过免疫组织化学或组织芯片 的方法实现。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，免疫组织化学所用的三种单克隆抗体，其 至少包括两种不同种属来源。4.一种用于弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 包含针对CDlO蛋白的特异性抗体及量子点标记物；针对Bcl-6蛋白的特异性抗体及量子点标记物；针...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋凯，张庆华，李军民，
申请(专利权)人：上海生物芯片有限公司，上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]