一种高通量筛选蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量筛选蛋白的方法，该方法的步骤如下：１）利用重组融合蛋白Ｎ端处的标签对蛋白进行高通量纯化；２）将步骤１）纯化得到的蛋白制备蛋白芯片，与抗所述Ｎ端处标签的单克隆抗体反应，筛选得到目的蛋白。在一个优选的实施方案中，所述Ｎ端处的标签为６×Ｈｉｓ标签；所述单克隆抗体为抗６×Ｈｉｓ标签的单克隆抗体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及。
技术介绍
随着分子生物学技术的进展，外源基因的克隆表达变得越来越简单。但是分子生 物学的最终目的是要得到纯的表达产物，以用于其生物学作用的研究。目前表达蛋白纯化 的方法包括离子交换层析、疏水层析、分子筛和亲和层析等。利用与GST、His等标签融合而 进行的亲和层析是最常用的蛋白纯化方法之一。这种方法基于目的蛋白与固相化的配基特 异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子的原理，不需要严格的摸索各个蛋白纯化的条件从 而使得蛋白的高通量纯化成为可能。蛋白微阵列技术与蛋白相互作用的研究首先要求能够 获得大量的蛋白，因此建立高通量蛋白纯化的平台变得尤为重要。但到目前为止，关于重组 蛋白高通量纯化方法的文献并不多。市场上已有的蛋白高通量纯化试剂盒价格昂贵并且不 能根据需要进行组合调整。基因芯片技术的应用尤其是能够在mRNA水平同时检测成千上万种基因的cDNA芯 片的应用使生物学家对生物体有了更系统全面地认识。相对于核酸研究来说，高通量的蛋 白研究仍然处于起步阶段。蛋白微阵列技术为同时研究成千个蛋白-蛋白、抗原-抗体、配 体-受体、蛋白-核酸技术提供了有力的手段。这就要求我们能够高通量的进行蛋白的表 达及纯化。因此，本领域迫切需要提供一种简便、快速、经济的高通量筛选蛋白的方法，并且 将其运用到蛋白微阵列技术与蛋白相互作用的研究中。
技术实现思路
为了克服上述技术问题，本方面提供了，该方法的步 骤如下1)利用重组融合蛋白N端处的标签对蛋白进行高通量纯化；2)将步骤1)纯化得到的蛋白制备蛋白芯片，与抗所述N端处标签的单克隆抗体反 应，筛选得到目的蛋白。在一个优选的实施方案中，所述N端处的标签为6 X Hi s标签。在另一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体为抗6XHis标签的单克隆抗体。在一个更优选的实施方案中，本专利技术方法的步骤如下1)利用重组融合蛋白N端所带的6XHis标签，通过96孔板对大肠杆菌表达的蛋 白进行高通量纯化；2)将步骤1)纯化得到的蛋白制备蛋白芯片，与抗6XHis的单克隆抗体反应，筛选 得到目的蛋白。在本专利技术实施例中，使用本专利技术的方法可以在两个星期内完成了对149个重组蛋 白的纯化。这种简便、快捷、经济的蛋白高通量纯化技术平台的建立，为大规模蛋白的研究提供了基础。 具体实施方案下面将结合实施例进一步详细地描述本专利技术。然而应当理解，列举这些实施例只 是为了起说明作用，而并不是用来限制本专利技术的范围。实施例1蛋白高通量纯化1.1 材料172个鼠疫耶尔森氏菌毒力相关蛋白的大肠杆菌表达克隆(在pET_32a表达系统 中)来自军事医学科学院微生物流行病研究所。所有克隆进行PCR和SDS-PAGE鉴定，均能 表达目的蛋白。96深孔培养板、96孔滤板(0.45 μ m)购自Millipore公司。Ni-NTA树脂、 BCA蛋白浓度检测试剂盒分别为QIAGEN和PIERCE公司产品，抗_6XHis单克隆抗体购自 sigma公司ο1.2 方法1. 2. 1细菌培养将含氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LB培养基分装至96深孔培养 板中，172个表达不同鼠疫菌毒力相关蛋白的大肠杆菌重组菌分别接种于相应培养孔中， 250r/min，37°C培养过夜。次日随机抽取菌液用紫外分光光度计检测0D600。并按0D600 = 0. 1重新稀释至新的含1.5mL LB培养基的96孔培养板中，25°C培养4天后加IPTG(终浓度 ImM/L)诱导4天。4000r/min离心集菌，弃上清后每孔加入200 μ L去离子水洗菌。1. 2. 2细菌裂解将菌重悬于100 μ L的细菌裂解液中(50mM/LNaH2P04、 500mM/L NaClUO % 甘油、20mM/L 咪唑，pH 8.0)，力口 10 μ L 溶菌酶(200 μ g/mL)和 Trition-100 (0. 1 % )混合液 4 °C，300rpm/min 作用 30min 后，力卩 10 μ L DNA 酶混合液 (900mM/L MgS04,100mM/L MnCl2，0. 5 μ g/mL DNA 酶)300r/min 继续作用 15min 直至菌液不 再粘稠。1. 2. 3上清分离将96孔滤板叠放在96浅孔板上，以排枪将细菌裂解液转移至96 孔滤板内，3000r/min离心5min。此时细菌裂解液上清将被转入96浅孔板内，残渣留在滤 板上。1. 2. 4目的蛋白的纯化在一新的96孔滤板中加入20 μ L已经用裂解缓冲液平衡 过的Ni-NTA，4°C下将96浅孔板中的上清加入滤孔板中结合45min，3000r/min离心5min弃 上清。加 200 μ L 洗涤缓冲液(50mM/L NaH2P04、500mM/L Nacl、10%甘油、30mM/L 咪唑，pH 8. 0) 4°C，200r/min洗涤5min，3000r/min离心去上清。重复2次后将滤板叠放在新的96浅 孔板上加 50 μ L 洗脱缓冲液(50mM/LNaH2P04、500mM/L NaCl、30 %甘油、300mM/L 咪唑，pH 8. 0) 4°C，200r/min 作用 5min 后 3000r/min 离心 Imin,重复两次。1. 2. 5纯化效果的验证将纯化出的蛋白取10 μ L加于384孔板中，SpotArrayTM 72点样仪以4X4的矩阵将蛋白点在醛基化玻片上构建蛋白芯片，每个矩阵内为6X6个点。 通过玻片上修饰的醛基与蛋白质氨基间的作用将蛋白固定在玻片上。4°C放置过夜使蛋白 牢固的结合在玻片上。第二日取出芯片首先以的BSA封闭1小时，然后与1 1000鼠 抗6XHis的抗体室温反应1小时，PBS漂洗后再与荧光素Cy5标记的羊抗鼠IgG反应。风 干后，用GenePieX Personal 4100A芯片扫描仪扫描，根据荧光信号/背景彡3的标准确认 符合后续实验要求的蛋白。荧光信号/背景<3的蛋白改变培养条件或在变性条件的方法下再次纯化。同时将荧光信号/背景≥ 3的蛋白随机挑选9个进行SDS-PAGE电泳，了解纯 化蛋白的纯度。并取10μ L以BCA蛋白检测试剂盒检测纯化蛋白的浓度，具体方法参照产 品说明进行。实施例2蛋白高通量筛选2.1蛋白芯片的制备将纯化出的所有蛋白产物转移至384孔板中，以16根点样针按4X4的矩阵在醛 基化玻片上点制芯片，每种蛋白重复3次，在每一矩阵左下角点一荧光素Cy5标记的羊抗兔 IgG作为矩阵识别点。制备好的蛋白芯片与抗6XHis的抗体反应，扫描后根据荧光信号/ 背景≥3为标准进行蛋白的剔除，将荧光信号/背景≥ 3的蛋白-70°C保存，其余蛋白通过 改变培养温度和IPTG诱导浓度重新纯化。2. 2纯化蛋白的纯度检测随机挑选荧光信号/背景≥3的9个蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果所有的通过96 孔板高通量纯化的蛋白均表现出与预期大小相同的目的蛋白，并且无明显杂带，说明96孔 板高通量蛋白纯化并通过蛋白芯片挑选出满足后续试验要求的蛋白的可行性。2. 3纯化蛋白的浓度检测以BCA蛋白检测试剂盒检测纯化蛋白的浓度，结果样本蛋白浓度大多在50 200 μ g/mL范围内，此高通量纯化出的蛋白完全适用于下一步的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量筛选蛋白的方法，其特征在于，该方法的步骤如下：１）利用重组融合蛋白Ｎ端处的标签对蛋白进行高通量纯化；２）将步骤１）纯化得到的蛋白制备蛋白芯片，与抗所述Ｎ端处标签的单克隆抗体反应，筛选得到目的蛋白。

【技术特征摘要】
一种高通量筛选蛋白的方法，其特征在于，该方法的步骤如下1)利用重组融合蛋白N端处的标签对蛋白进行高通量纯化；2)将步骤1)纯化得到的蛋白制备蛋白芯片，与抗所述N端处标签的单克隆抗体反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：张婧，
申请(专利权)人：张婧，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]