本发明专利技术公开了胃癌的血浆miRNA生物标志物组合及其应用，包括以下血浆miRNA：miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p，以miR-16作为内参。对miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p联合检测可获得良好的胃癌诊断价值，可以实现胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断。以miR-16作为内参，极大地提高了对本发明专利技术胃癌血浆miRNA生物标志物组合检测时相对定量的准确度。以本发明专利技术的生物标记物组合为靶标开发的胃癌miRNA检测试剂盒，检测快速方便、检测灵敏度、特异性高、成本低，可以满足绝大多数胃肿瘤病人的检测需求，应用范围广，经临床验证预测准确率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
中的miRNA及其应用，特别是设及胃癌的血浆miRNA生 物标志物组合及其在胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断中的应用。
技术介绍
胃癌是常见恶性肿瘤之一，其死亡率位居第=。最近数据表明，在我国城市男性恶 性肿瘤发病率和女性恶性肿瘤死亡率排名中，胃癌均位列第二，是严重威胁人类健康和制 约经济社会发展的重大公共健康问题。胃癌的早期诊断意味着可W提早干预治疗，对患者 的预后意义重大。目前，用于胃癌诊断主要依赖于内镜活检，而运种方法有创，给患者带来 痛苦，且对实施此项技术的医师有较高要求。胃癌的无创检查方法主要是血清肿瘤标志物， 例如癌胚抗原CEAXA199等，但是诊断的灵敏度和特异性较低。因此，寻找具有较高灵敏度 和特异性的肿瘤标志物对胃癌患者的早诊早治具有重要意义。 微小RNA(microRNA，miRNA)是一类平均长度约22(19-24)个核巧酸的非编码RNA， 它广泛参与了机体正常生理活动调节。miRNA可W同时调节众多祀基因，其在细胞中的异常 表达将会导致肿瘤的产生。miRNA不但能在肿瘤组织中检测到，而且在众多体液中也能稳定 存在，能耐受酸碱等极端环境。不仅如此，有研究指出不同肿瘤患者血浆中miRNA的种类具 有特异性，运种特性为利用miRNA作为非侵入性的诊断标志物进行早期胃癌检测提供了契 机。在胃癌检测中，肖斌等专利技术了利用组织中的miR-3化检测（或诊断）胃癌的试剂盒，利 用组织中的miR-3化检测（或诊断）胃癌具有灵敏度较高（达93. 33%)的优点，但是此 专利技术没有提及miR-3化诊断胃癌的特异性如何，也即区分正常人群的能力，另一方面，该试 剂盒应用上受限，运是由于受检物癌灶组织标本需要经侵入性操作取得，况且如果能取得 胃癌原发灶组织，完全可W通过病理来诊断（肖斌，邹全明，朱恩东，黎伯胜，毛旭虎， 李娜，郭刚.一种用于诊断或检测胃癌的试剂盒.重庆：CN102002532A，2011-04-06.)。 进一步的，张正东等专利技术了利用血浆/血清中miR-148a、miR-142、miR-26a和miR-195四种 miRNA中的一种或几种诊断胃癌的试剂盒（张正东，王美林，康美云，刘桑，储海燕，全 娜，吴冬梅，赵庆洪，薬伟达.检测胃癌的血清/血浆微小RNA标志物及其应用.江 苏：CN103773761A，2014-05-07.)，在此种试剂盒中，U6基因作为内参，但已有文献报道U6 基因在血浆中表达并不稳定，因而WU6基因作为内参基因计算W上四种miRNA的含量就 有可能产生误差，进而影响诊断的准确性度enzF,RoderburgC,VargasCD,etal.U6is unsuitablefornormalizationofserummiRNAlevelsinpatientswithsepsisor liverfibrosis.ExpMolMed. 2013. 45:e42;XiangM,ZengY,YangR,etal.U6isnota suit曰bleendogenouscontrolforthequ曰ntific曰tionofcircul曰tingmicroRNAs. BiochemBio地ysResCommun. 2014. 454(1) : 210-4.)，另外，此专利技术是利用四种miRNA中的 一种或几种诊断胃癌，但是，专利技术人并没有说明何时采用一种miRNA诊断，何时采用两种、 =种或四种miRNA联合诊断，也没有说明何时采用血清诊断，何时采用血浆诊断，而且如果 当用一种miRNA诊断胃癌的结果与用多种miRNA联合诊断胃癌的结果不一致时，也就是说 若一种miRNA诊断结果判定为胃癌，而多种miRNA联合诊断同一受试者结果判定为非胃癌 时，此时该如何判定诊断结果，此专利技术中均未说明，无疑会给使用者造成困扰。因此，迫切需 要一种准确、特异、灵敏的利用miRNA诊断胃癌的方法及其专用引物、探针与试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一组用于胃癌早期诊断和罹患风险评估的血浆miRNA 标志物组合，利用该血浆miRNA生物标志物组合可用于诊断受试者是否罹患胃癌并进行罹 患风险评估。 本专利技术所提供的胃癌的血浆miRNA生物标志物组合，包括W下血浆miRNA: miR-190a、miR-331-5p、miR-362-化和miR-369-化，W及miR-16 作为内参。其中，miR-190a 的序列如序列表中SEQIDNO. 1所示，miR-331-5p的序列如序列表中SEQIDNO. 2所示， miR-362-化的序列如序列表中SEQIDNO. 3所示，miR-369-化的序列如序列表中SEQID NO. 4所示，miR-16的序列如序列表中SEQIDNO. 5所示。 本专利技术的miRNA生物标志物组合能在血浆中稳定存在，其在正常人血浆、胃良性 病变患者血浆和胃恶性肿瘤患者血浆中的表达量具有差异性，因此，能用于胃肿瘤筛查、辅 助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断。因此，本专利技术的miRNA生物标志物组合在胃肿瘤筛查、辅助 胃肿瘤病理鉴定及胃癌早期临床诊断中的应用也属于本
技术实现思路
。W上述血浆miRNA生物标志物组合为祀标，用基于化qMan探针的实时巧光定量 PCR技术可用于诊断胃癌。 因此，上述血浆miRNA组合作为胃癌早期联合诊断生物标志物的应用也是本专利技术 内容。在所述PCR检测中所述miR-190a、miR-331-5p、miR-362-化和miR-369-化各生物 标志物联合使用按下式系数分配用于对胃癌进行判断：Y- 6. 302XAmiR1903+18.486XBmiR331Sp+50.194XCmiR3623P+16.113XDmiR3脚化 其中，AmiKigOa是miR-igOa在血浆中的表达量（2 &&G准），BmiK33i日p是miR-33l-5p 在血浆中的表达量（2 & 值），CmiK3日2 3P是miR-362-化在血浆中的表达量（2 值）， DmiR369 3P是miR-369-化在血浆中的表达量（2 & 值）。 本专利技术的另一目的是提供一种用于胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断 的miRNA试剂盒。 本专利技术所提供的miRNA试剂盒，包含与所述miRNA生物标志物组合PCR检测相关 的引物，分别为：miR-190a的RT引物（序列表中SEQIDNO. 6所示）和F端引物（序列表中SEQ IDNO. 11 所示）；miR-331-5p的RT引物（序列表中SEQIDNO. 7所示）和F端引物（序列表中SEQ IDNO. 12 所示）；miR-362-化的RT引物（序列表中SEQIDNO. 8所示）和F端引物（序列表中SEQ IDNO. 13 所示）；miR-369-化的RT引物（序列表中SEQIDNO. 9所示和F端引物（序列表中SEQ IDNO. 14 所示）；[001引 内参miR-16的RT引物（序列表中SEQIDNO. 10所示）和F端引物（序列表中 沈QIDNO. 15所示）；W及 通用R端引物（序列表中SEQIDNO. 16所示）。 上述试剂盒具体可包括W下引物和探针：[00本文档来自技高网...
【技术保护点】
胃癌的血浆miRNA生物标志物组合，包括以下血浆miRNA：miR‑190a、miR‑331‑5p、miR‑362‑3p和miR‑369‑3p，以及miR‑16作为内参；其中miR‑190a的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，miR‑331‑5p的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，miR‑362‑3p的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，miR‑369‑3p的序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，miR‑16的序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈凛，张珂诚，郗洪庆，崔建新，吴晓松，卫勃，边识博，马连港，李佶阳，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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