所述公开的内容提供了使用一含有在所述3’端有一第一目标结合区域和在所述5’端有一第二目标结合区域和两者之间的有连接区域的发夹寡核苷酸扩增一目标核酸的方法。所述连接区域可包括多种的用户定义的序列或原件，可以对所述目标核酸进行进一步操作。比如，扩增、鉴定和/或测序后的捕获。所述目标结合区域与所述目标核酸结合，其3’端作为一引物起始所述目标核酸序列的延伸，所述间隙的连接产生一环状核酸的形成。所述环状引物能用于多种过程，包括扩增和测序。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】使用发卡寡核苷酸扩増核酸的方法相关申请的交叉引用本申请是申请日为2013年3月15日、申请号为61/789，685的临时申请的非临时专利申请，所述非临时专利申请此处全文纳入。关于联邦研究或发展资助的申明无以光盘形式提交的相关参考资料无专利技术背景(I)所述专利技术的领域本专利技术与核酸扩增的方法有关，具体地，使用发夹寡核苷酸扩增核酸。(2)
技术介绍
描述对本领域技术人员而言有许多已知的扩增核酸的方法。提供从一样本中特异性地捕获一目标核酸的方法，有助于纯化、扩增和/或检测该特异性目标。本专利技术提供了捕获特异性核酸以进行包括扩增和测序在内的进一步操作的方法。所述专利技术简要总结本专利技术提供了固定和扩增一目标核酸的方法。在一方法中，一发夹寡核苷酸与一目标核酸混合。所述发卡寡核苷酸含有在所述3’端的一第一目标结合区域和在所述5’端的一第二目标结合区域和两者之间的用户定义的连接区域。所述连接区域可包括多种的用户定义的序列或原件，譬如，所述连接区域可包括一个或多个下列原件或其任意的组合:一引物位点、一锚位点和/或一条形码序列。优选的，所述连接区域包括至少一个捕获原件和至少一个引物结合位点。所述发夹寡核苷酸的所述第一和第二目标结合区域退火后与所述目标核酸结合，所述发夹寡核苷酸通过聚合酶从其3’端向5’端延伸以产生一第一双重核酸。所述第一双重核酸包括一第一核酸和所述目标核酸。所述第一核酸的末端由连接酶连接以产生一环状核酸。所述环状核酸从所述目标核酸移除，然后通过由一固相载体所提供的一捕获手段捕获。捕获也可由本领域已知的多种方法所实现。优选的，所述捕获手段与所述连接区域的所述捕获原件结合。可选择地，所述环状第一核酸/目标复合物可被捕获至一固相载体上，然后所述第一核酸与所述目标核酸分离。能够与所述连接区域的至少一个引物结合位点结合的一引物与所述环状核酸混合，通过聚合酶延伸一产生一含有一第二核酸和一第一核酸的第二双重核酸。所述第二核酸，或所述扩增的目标核酸，从所述第一核酸移除，现在可进行后续操作步骤，包括使用PCR扩增、捕获、检测和/或包括第二代测序的测序。本专利技术的其他方面参见于所述说明书的全文中。图片简述图1是本专利技术中一个方法的示意图。本专利技术详细描述除非特别说明，此处所用的所有术语都与本专利技术所属的本领域技术人员所通常理解的含义相同。此处公开全文所引用的所有专利、专利申请和出版物都以它们全文的形式被引用。若此处的某一术语含有多重的定义，则以本部分最通常的定义为准。此处所用术语“寡核苷酸”指核苷酸的一聚合物形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核酸，含有天然或非天然的核苷酸，长度至少为2，通常在约5至约200，或者更常见地至约100。因此，该术语包含双链和单链DNA和RNA。此外，寡核苷酸可抗核酸酶，包括但不限于2’ -O-甲基核糖核苷酸、硫代核苷酸、二硫代核苷酸、磷酰胺核苷酸和甲基膦酸酯核苷酸。此处所用术语“目标”、“目标序列”或者“目标核苷酸”指一含有一所关注的多聚核苷酸的核酸，需要对其进行纯化、分离、捕获、固定、扩增、鉴定、检测、定量、质量测定和/或测序以及类似操作。所述目标序列就其实际序列而言可已知或未知。此处所用术语“引物”或“引物序列”是指含有挑选到的与将扩增的每一特定序列基本上互补的序列的核酸。更具体地，引物是与它们相应的目标杂交充分互补的。因此，所述引物序列不需要准确地反映所述目标的精确的序列。所述引物中可散布非互补碱基或更长的序列，只要所述引物序列与所述目标核酸的序列具有足够的互补性以允许杂交和延伸。此外，引物可抗核酸酶并包括经过修饰以阻止核酸外切酶降解的引物。在一些实施方案中，所述引物已经过修饰以保护不被3’或5’端核酸外切酶的活性所降解。这些修饰包括但不限于2’ -O-甲基核糖核苷酸修饰、硫代骨架修饰、二硫代骨架修饰、磷酰胺骨架修饰、甲基膦酸酯骨架修饰、3’端磷酸修饰和3’烷基取代。在一些实施方案中，在一扩增反应中施用的所述引物和/或探针通过一种或多种修饰保护不被3’或5’端核酸外切酶的活性所降解。技术人员能够设计和准备适于延伸一目标序列的引物。此处提供的应用于所述方法和组分的引物的长度取决于多种因素，包括鉴定所述核苷酸序列特性及这些核酸在杂交或在体外核酸延伸时的温度。对具备通常手段的人员而言，其知晓决定上述针对具有一特定序列特性的所述引物的优选长度所要考虑的事宜。术语“载体”或“固相载体”指传统的载体，其包括，如微量滴定孔、玻璃粉、微粒或纤维的聚合物，和诸如载玻片、试管等捕获分子与之共价键或非共价键结合的硅烷或硅酸盐载体。此处所用术语“样本”指本质上任何含有所期望的目标核酸的样本，包括但不限于分离自一人或一动物的组织或体液，包括但不限于，譬如，血液、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、眼泪或唾液、尿液、精子、粪便、痰液、呕吐物、胃吸出物、支气管吸出物、棉签拭样(鼻咽的、直肠的、眼的、泌尿生殖器的等)、器官、肌肉、骨髓、石蜡包埋组织、皮肤、肿瘤和/或获取自所述生物体任何部分的细胞；植物材料、细胞、液体等；一单独的细菌、菌群及其培养物、食物、化妆品、药品/药物、通过生物工艺准备的材料(终产品和中间材料)、水、环境样品，包括但不限于，譬如，土壤、水和空气；从以上所列所述来源中获得的半纯化或纯化的核酸，诸如，作为一过程的结果的核酸，如测序的模板形成，包括下一代测序、样本处理、核酸酶消化、限制酶消化、复制或类似。此处所用术语“扩增”指产生与一完整的目标核酸序列或其一部分或作为所述目标核酸序列的一替代物的通用序列的相同或互补的核酸链的过程。此处所用术语“固定”指一分子，诸如所述第一和第二寡核苷酸与一固相载体相连接。本领域通常已知的广泛的方法能用于连接。一优选的方法是共价键相连。此处所用术语“核酸”指一多核苷酸化合物，其包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括核苷或含有含氮杂环碱基或其碱基类似物的核苷类似物，通过标准磷酸二酯键或其他键合共价连接而成。核酸包括RNA、DNA、嵌合的DNA-RNA聚合物及其类似物。在一核酸中，所述骨架由多种键合方式构成，包括一个或多个糖-磷酸二酯键、肽核酸键(PCT N0.WO95/32305)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或其组合。在一核酸中，糖部分可为核糖、脱氧核糖或带有如2’甲氧基和2’卤素(如2’ -F)取代基的相似化合物。含氮碱基可为传统的碱基(A、G、C、T、U)，诸如异胞嘧啶和异鸟嘌呤的非天然核苷酸及其类似物(如肌苷，The B1chemistry of the Nucleic Acids5_36, Adams etal.，ed.，Ilth ed.，1992)，嘌呤和嘧啶碱基的衍生物，如N4_甲基脱氧鸟苷、氮杂或吖嘌呤、氮杂或吖嘧啶、在任意一系列化学位上有改变或取代的取代基的嘌呤或嘧啶，例如2-氨基-6甲氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4- 二甲肼-嘧啶及O4-烷基-嘧啶或者吡唑啉酮化合物，如非取代或3-取代吡唑啉酮嘧啶(如U.S.Pat.Nos.5，378，825，6，949，367 和 PCT N0.WO 93/13121)。核酸可包括“非碱基的”位置，其骨架在一个或多个位点上不包括一含氮碱基(U.S.Pat.N0.5，585，481)，如一个或多个非碱基位置可本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种扩增目标核酸的方法，所述方法包括步骤：A、在一含有一发夹寡核苷酸和一目标核酸的第一混合物中使一第一和一第二目标结合区域退火与一目标核酸结合，其中所述发夹寡核苷酸的3’端含有所述第一目标结合区域，5’端含有所述第二目标结合区域，在所述第一和所述第二目标结合区域之间含有用户定义的连接区域，其中所述连接区域含有一个或多个捕获原件，延伸所述发夹寡核苷酸通过所述目标核酸以产生一含有一第一核酸和所述目标核酸的第一双重核酸；B、连接所述第一核酸的末端以产生一环状核酸，选择性地从所述目标核酸移除所述环状核酸；C、在一第二混合物中在一固相载体上捕获所述环状核酸，其中所述固相载体含有一与所述连接区域的所述捕获原件结合的捕获手段，所述第二混合物含有一能与所述连接区域的至少一个引物结合位点结合的一引物，延伸所述引物以产生一含有一第二核酸和所述第一核酸的第二双重核酸；和，D、从所述第一核酸解离所述第二核酸，从而扩增所述目标核酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：莱尔·J·阿诺德，诺曼·C·纳尔逊，
申请(专利权)人：莱尔·J·阿诺德，诺曼·C·纳尔逊，
类型：发明
国别省市：美国;US
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