利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号传导寡核苷酸杂交的靶核酸序列的检测制造技术

本发明专利技术涉及利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸‑依赖性信号传导寡核苷酸杂交(PCE‑SH，PTO Cleavage and Extension‑Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization)的靶核酸序列的检测。本发明专利技术不使用与靶核酸序列杂交来提供靶信号的探针。本发明专利技术利用与以靶‑依赖性的方式形成的延伸链杂交的探针(信号传导寡核苷酸)，将具有人为选择的序列的捕捉和模板化寡核苷酸作为模板合成上述延伸链。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2012年7月3日、申请号为201280071069.2、专利技术名称为“利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号传导寡核苷酸杂交的靶核酸序列的检测”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号传导寡核苷酸杂交(PCE-SH，PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization)的靶核酸序列的检测(Detection of Target Nucleic Acid Sequence by PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization Assay)。
技术介绍
DNA杂交(hybridization)是分子生物学的基本的过程，受离子强度、碱基结构、核酸片段的长度、错配程度以及变性剂的存在的影响。基于DNA杂交的技术将成为决定特定核酸序列的非常有用的用具，将会明确有助于临床诊断、基因研究及法医学上的实验分析。但是，在仅依赖杂交的现有的方法以及过程中，发生因探针和非-靶序列之间的非-特异性杂交引起的假阳性结果的可能性高。因此，现有的方法以及过程存在改善可靠性的问题。除探针杂交过程以外还提出了利用酶反应的几种接近法，例如，TaqManTM探针方法。在TaqManTM探针方法中，与靶核酸序列杂交的标记探针基于上游引物-依赖性DNA聚合酶的5’核酸酶活性被切割，来产生表示靶序列存在的信号(美国专利第5210015号、第5538848号以及第6326145号)。TaqManTM探针方法提出用于信号产生的两个接近法：聚合-依赖性切割(polymerization-dependent cleavage)以及聚合-独立性切割(poly merization-independent cleavage)。在聚合-依赖性切割中，上游引物的延伸必须在核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触之前发生。随着延伸反应的进行，聚合酶逐渐地切割标记探针的5’-末端。在聚合-独立切割中，上游引物以及标记探针非常邻近，由此与靶核酸序列进行杂交，上游引物的3’-末端和核酸聚合酶的结合使上述核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触来放出标记。并且，TaqManTM探针方法公开，通过在其5’-末端部位具有不与靶序列杂交的5’-尾巴区域的标记探针被切割来形成包含5’-尾巴区域的片段。也有对具有对靶序列非-互补的5’-尾巴区域的探针被5’核酸酶切割，放出包含5’-尾巴区域的片段的几种方法的报告。例如，美国专利第5691142号就公开了对基于DNA聚合酶的5’核酸酶活性来被切割的切割结构。公开中例示了有对包含对模板非-互补的5’部位以及对模板互补的3’部位的寡核苷酸与模板杂交，并且，上游寡核苷酸与模板非常邻近而由此与模板进行杂交的切割结构。切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或具有减少的合成活性的变形DNA聚合酶切割，来放出与模板非-互补的5’部位。之后，被放出的5’部位与具有发夹结构的寡核苷酸杂交，形成切割结构。由此，诱导渐进性的切割反应来检测靶序列。美国专利第7381532号公开了具有3’-末端被阻断的上游寡核苷酸的切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或FEN核酸酶切割，来放出非-互补的5’皮瓣(flap)部位，被放出的5’皮瓣部位基于大小分析或者相互作用性双重标记来被检测的过程。美国专利第6893819号公开了能够检测的被放出的皮瓣基于核酸合成依赖性的、皮瓣-媒介连续性扩增方法而生成的内容。在此方法中，从第一个切割结构放出的皮瓣，以核酸合成依赖性方式切割第二个切割结构来从第二个切割结构放出皮瓣，并检测被放出的皮瓣。借助液相中的荧光-标记探针的杂交，即使利用一种荧光标记，也能够基于解链曲线分析来同时检测多个靶核酸序列。但是，在基于相互作用性-双重标记探针的5’核酸酶介导的切割来检测靶序列的现有技术中，在检测多重靶时，对互不相同的靶序列需要互不相同的种类的荧光标记，由于这种荧光标记的种类数量有限，因而检测出的靶序列的数量受限。美国申请公开号第2008-0241838号中公开了利用在靶核酸序列具有非-互补的5’部位的探针的切割以及捕捉(capture)探针的杂交的靶检测方法。标记位于非-互补的5’部位。杂交于靶序列的标记探针被切割而放出片段，之后，片段与捕捉探针杂交而检测靶序列的存在。在此方法中，未切割的/完好无损的(uncleaved/intact)探针不与捕捉探针杂交是必须的。为此，需要长度短的捕捉探针在固相基质上实现固定化。但是，这种限制会降低固相基质上的杂交效率，并且使反应条件的最优化变得困难。因此，对开发以更加便利、具有可靠性以及再现性的方式，不仅基于杂交，还基于5’核酸切割反应(5’nucleolytic reaction)等的酶反应，在液相以及固相中检测靶序列，更为优选地检测多个靶序列的新颖的接近法的要求正在抬头。并且，在本专利技术所属领域中正需求一种不受限于标记(尤其，荧光标记)种类的数量的新颖的靶检测方法。因此，要求开发一种克服现有技术的缺点，并且能够以更加便利、具有可靠性、且可再现的方式检测靶核酸序列的方法。在本说明书全文中参照多个引用文献及专利文献，其引用由括号来表示。引用的文献及专利的公开内容，作为参照全部包括在本说明书中，因此能够更加明确地说明本专利技术所属的
的水准及本专利技术的内容。
技术实现思路
要解决的问题本专利技术人为了开发具有更加得到改善的准确性以及方便性的，尤其以多重方式检测靶序列的新颖的接近法而锐意研究努力。其结果，本专利技术人定立了用于检测靶序列的新颖的方案，根据这种新方案，靶检测不仅包括探针杂交，还包括5’核酸切割反应(5’nucleolytic reaction)及延伸等的酶反应和延伸反应-依赖性杂交反应。本专利技术的方案不仅优秀地适用于固相反应，而且也能够优秀地适用于液相反应，具有更加得到改善的准确性以及方便性，能够检测多个靶序列。因此，本专利技术的目的在于，提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号传导寡核苷酸杂交(PCE-SH，探测和标记寡核苷酸Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization)来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法。本专利技术的再一目的在于，提供用于利用PCE-SH来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒。以下实施例、专利技术要求保护范围及附图能够使本专利技术的其他目的及优点更加明确。附图说明图1示出了利用于PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization)试验的探测和标记的寡核苷酸(PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide)、捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide)以及信号传导寡核苷酸(SO，Signa本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸‑依赖性信号传导寡核苷酸杂交(PCE‑SH)测定来检测靶核酸序列内的核苷酸变异的方法，其中包括：(a)使所述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸(PTO)进行杂交；所述上游寡核苷酸包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；所述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’‑靶向部位，其包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；(ii)5’‑标记部位，其包含与所述靶核酸序列非‑互补的核苷酸序列；以及(iii)核苷酸变异区别位点，其包含与靶核酸上的核苷酸变异互补的序列；所述核苷酸变异区别位点位于3’‑靶向部位的5’‑末端部分，所述3’‑靶向部位与所述靶核酸序列杂交，所述5’‑标记部位不与所述靶核酸序列杂交，所述上游寡核苷酸位于所述探测和标记寡核苷酸的上游，所述上游寡核苷酸或其延伸链诱导具有5’核酸酶活性的酶对探测和标记寡核苷酸的切割；(b)在用于切割所述探测和标记寡核苷酸的条件下，使所述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；其中当所述探测和标记寡核苷酸与具有对所述核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交，并且所述3’‑靶向部位的5’‑末端部分与靶核酸序列形成双链而诱导从第一初期切割位置切割时，则放出第一片段；其中当所述探测和标记寡核苷酸与具有对所述核苷酸变异区别位点非‑互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交，并且所述3’‑靶向部位的5’‑末端部分不与靶核酸序列形成双链而诱导从位于第一初期切割位置下游的第二初期切割位置进行切割时，则放出第二片段；所述第二片段包含额外的3’‑末端部位，这使第二片段与第一片段不同；(c)使从所述探测和标记寡核苷酸放出的所述片段与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO)进行杂交；所述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与所述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位互补的核苷酸序列或者与5’‑标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含分别与所述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位以及3’‑靶向部位非‑互补的核苷酸序列；从所述探测和标记寡核苷酸放出的第一片段或第二片段与所述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；(d)利用模板‑依赖性核酸聚合酶及所述步骤(c)的结果物来实施延伸反应；若所述第一片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则所述第一片段被延伸，来生成包含与所述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸序列的延伸链，若所述第二片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则不被延伸；(e)使所述延伸链与信号传导寡核苷酸杂交的步骤；所述信号传导寡核苷酸包含与所述延伸链互补的序列以及至少一个标记，且所述信号传导寡核苷酸与所述延伸链杂交来提供能够检测的信号；以及(f)检测所述信号；所述信号的检测表示与所述探测和标记寡核苷酸的核苷酸区别部位互补的核苷酸变异的存在。...

【技术特征摘要】
2012.02.02 KR 10-2012-0010681;2012.03.20 KR 10-2011.利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号传导寡核苷酸杂交(PCE-SH)测定来检测靶核酸序列内的核苷酸变异的方法，其中包括：(a)使所述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸(PTO)进行杂交；所述上游寡核苷酸包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；所述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，其包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；(ii)5’-标记部位，其包含与所述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；以及(iii)核苷酸变异区别位点，其包含与靶核酸上的核苷酸变异互补的序列；所述核苷酸变异区别位点位于3’-靶向部位的5’-末端部分，所述3’-靶向部位与所述靶核酸序列杂交，所述5’-标记部位不与所述靶核酸序列杂交，所述上游寡核苷酸位于所述探测和标记寡核苷酸的上游，所述上游寡核苷酸或其延伸链诱导具有5’核酸酶活性的酶对探测和标记寡核苷酸的切割；(b)在用于切割所述探测和标记寡核苷酸的条件下，使所述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；其中当所述探测和标记寡核苷酸与具有对所述核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交，并且所述3’-靶向部位的5’-末端部分与靶核酸序列形成双链而诱导从第一初期切割位置切割时，则放出第一片段；其中当所述探测和标记寡核苷酸与具有对所述核苷酸变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交，并且所述3’-靶向部位的5’-末端部分不与靶核酸序列形成双链而诱导从位于第一初期切割位置下游的第二初期切割位置进行切割时，则放出第二片段；所述第二片段包含额外的3’-末端部位，这使第二片段与第一片段不同；(c)使从所述探测和标记寡核苷酸放出的所述片段与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO)进行杂交；所述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与所述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位互补的核苷酸序列或者与5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含分别与所述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从所述探测和标记寡核苷酸放出的第一片段或第二片段与所述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；(d)利用模板-依赖性核酸聚合酶及所述步骤(c)的结果物来实施延伸反应；若所述第一片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则所述第一片段被延伸，来生成包含与所述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸序列的延伸链，若所述第二片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则不被延伸；(e)使所述延伸链与信号传导寡核苷酸杂交的步骤；所述信号传导寡核苷酸包含与所述延伸链互补的序列以及至少一个标记，且所述信号传导寡核苷酸与所述延伸链杂交来提供能够检测的信号；以及(f)检测所述信号；所述信号的检测表示与所述探测和标记寡核苷酸的核苷酸区别部位互补的核苷酸变异的存在。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述信号传导寡核苷酸的至少一部分包含与所述延伸序列互补的序列。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述能够检测的信号是由(i)与所述信号传导寡核苷酸相结合的标记；(ii)与所述信号传导寡核苷酸相结合的标记及与从所述探测和标记寡核苷酸放出的片段相结合的标记的组合；(iii)与所述信号传导寡核苷酸相结合的标记及在步骤(d)的延伸过程中掺入于所述延伸链的标记的组合；或(iv)与所述信号传导寡核苷酸相结合的标记以及嵌入染料的组合来提供。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕捉和模板化寡核苷酸(CTO)的序列被选择为，所述捕捉和模板化寡核苷酸不与第二片段的额外的3’末端部分杂交，以防止第二片段与所述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部分杂交时第二片段发生延伸。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸变异区别位点位于与所述探测和标记寡核苷酸(PTO)的3’靶向部分的5’－末端间隔10个核苷酸的范围内。6.根据权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：千钟润，李荣祚，
申请(专利权)人：SEEGENE株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR