分析试样内靶分析物的方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及确定试样内靶分析物的存在或不存在的方法及装置。本发明专利技术将对于数据集非线性函数的匹配准确度用为用于分析靶分析物的直接指标，从而，可以在没有假阳性及假阴性结果，尤其，没有假阳性的情况下分析靶分析物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分析试样内靶分析物的方法及装置
本专利技术涉及分析试样内靶分析物的方法及装置。
技术介绍
为了核酸扩增而普遍使用的聚合酶链反应(Polymersechainreacion，PCR)包括双链DNA的改性、向DNA模板的的寡核苷酸引物的退火及基于DNA聚合酶的引物延伸的反复循环过程(Mullis等，美国专利第4683195号、第4683202号及第4800159号；Saikietal.，Science230：1350-1354(1985))。实时聚合酶链反应(Real-timePCR)为用于在试样实时检测靶核酸分子的基于聚合酶链反应的技术中的一种。为了检测特定靶分析物，实时聚合酶链反应利用与靶分子的量成比例来发生可检测的荧光信号的信号发生单元。获取包含各个测定位置及在上述测定位置中的信号值的数据集。荧光信号的强度与靶分子的量成比例。从数据集获取表示测定位置与荧光信号的强度关系的扩增曲线(amplificationcurve)或扩增轮廓曲线(amplificationprofilecurve)。通常，基于实时聚合酶链反应的扩增曲线分为基础线(baseline)区域、指数(exponential)区域、停滞(plateau)区域。指数区域为与聚合酶链反应扩增产物的增加成比例来释放的荧光信号增加的区域，停滞区域为聚合酶链反应扩增产物的增加及荧光信号的释放达到饱和状态而无法再增加荧光信号的区域。基础线区域为在聚合酶链反应初期循环中几乎没有荧光信号的变化的区域。在基础线区域中，聚合酶链反应产物所释放的荧光信号并不充分达到能够被检测的程度，因此，作为反应试样自身的荧光信号和测定系统自身的荧光信号的背景信号(backgroundsignal)可占据基础线区域的荧光信号的大部分。已开发了从实时聚合酶链反应的数据判断是否存在靶分析物的扩增的多种方法。例如，利用阈值(thresholdvalue)的方法。利用阈值的方法预先确定与需要分析的所有方法的特定的信号阈值(adefinedsignalthresholdforallreacionstobeanalyzed)，判断数据集的信号值是否达到(reach)或超过(exceed)上述特定的信号阈值的方法。但是，利用特定的信号阈值来判断是否扩增有可能具有如下的判断错误，即，(i)非正常信号值或噪音信号值达到阈值而发生的假阳性判断，而并非为基于扩增的信号值；(ii)基于基线(baselining)错误的假阴性判断；以及(ⅲ)基于非正常信号值或噪音信号值的错误的(Ct，Cyclethreshold)值的算出。并且，利用阈值的方法存在为了导出适用于各个反应的特定的信号阈值而需要大量收集实际反应数据集的问题。JeffreyLerner在美国授权专利第8560247号中揭示了如下的方法，即，获取对数据匹配的函数，根据上述函数的斜率(slope)是否大于最大扩增斜率界限(maximumamplificationslopebound)来确定是否存在跳跃错误(jumperror)。在上述方法中，当计算匹配数据的函数时，计算与在基础线区域中的一部分数据匹配的函数，而并非计算与整个数据匹配的函数。在上述方法中，若与数据匹配的基础线区域的函数的斜率大于最大扩增斜率界限，则确定为存在跳跃错误。因此，上述方法无法利用函数的最大扩增斜率来确定试样内是否存在靶分析物，仅可确定跳跃错误的存在与否。RonaldT.Kurnik等揭示了如下的判断，即，判断美国公开专利第2009-0119020号中的如聚合酶链反应曲线的成长曲线(growthcurve)的数据是否有效(valid)或者是否显著(significant)成长。上述方法将数据与二次函数匹配来获取匹配的二次函数，在求出二次函数的统计学有意义的值(例如，R-square值)之后，判断统计学有意义的值是否大于预先确定的特定阈值(例如，0.90-0.99)。在上述方法中，在统计学有意义的值大于预先确定的阈值的情况下，确定为在数据中不存在有效或显著的成长(growth)。上述方法揭示了如下的结构，即，数据与二次函数越准确地匹配，靶分析物不存在的概率越高，因此，在R-square(R2)值大于阈值的情况下，将丢弃(discard)数据。但是，在上述方法中，利用二次函数的匹配来仅确定靶分析物不存在，为了判断靶分析物的存在，需要实施求出循环阈值的额外的步骤。作为用于判断在从实时聚合酶链反应获取的数据中是否存在有意义的靶分析物的扩增的方法，需要更加有效的方法。利用荧光信号的试样的分析如下进行。首先，通过LED等的光源来向发光体供给能量，通过所接受的能量，在发光体的电子处于激活的状态并回到基态的过程中，发光体将释放(emit)特定波长的光。分析设备利用光二极管(Photodiode)或CCD等来将特定波长的光变为电信号并提供试样分析所需要的信息。即使在试样中发生相同量的发光体，因设备之间光源(例如，LED)等的光亮的差异(unevenillumination)、广电变换装置的性能偏差(variation)，每个分析设备也将提供不同的信号值。将设备之间的信号差异称为设备间信号偏差。不仅是设备间信号偏差，而且通过单一的相同分析设备，对相同种类、相同量的靶分析物实施的多个反应的分析结果有可能具有信号偏差。这是因为如执行反应的设备上的反应容器的位置差异、反应混合物组成或浓度的细微差异的多种反应环境的差异。将在相同设备内的反应中的信号差异称为设备内信号偏差。为了测定数据的准确、可靠性高的分析，需要解决如信号偏差的问题，为了解决问题而使用多种方法。作为最基本的方法，利用硬件校准方法。例如，当生产分析设备时，如LED光源的强度的各个分析设备的一部分部件的特性将被校准或调解，以减少对于相同试样的设备之间的信号偏差并维持在适当范围。另一方法为利用基准染色剂(referencedye)的方法。在反应中一同包含生成规定量的信号的基准染色剂(例如，ROXTM或fluorescein)，来利用从基准染色剂发生的信号来校准在试样中发生的信号。以往的方法具有几种限制。硬件校准在准确度方面存在限制，为了去除因分析设备的老化而发生的偏差而需要追加进行校准。此外，硬件校准仅可减少设备之间的信号偏差，而无法减少设备内信号偏差。利用基准染色剂的信号的校准将增加每次反应的成本，在各个反应中所利用的基准染色剂中的量及质的偏差(variation)有可能引起其他误差(error)。并且，基准染色剂的利用可以增加上述基准染色剂与在反应混合物中确定靶分析物的存在所利用的其他染色剂(dye)之间的干扰现象的可能性。尤其，在利用多个染色剂且需要检测这些荧光的多重聚合酶链反应中，干扰现象为极为重要的问题。并且，若为了信号校准而分配一个染色剂及一个检测通道，则可以同时检测一个少量的靶，因此，在产品竞争力侧面存在严重的缺陷。因此，需要开发在没有对于硬件的直接控制或不追加使用基准染色剂的情况下，可校准数据集并可减少设备之间及设备内信号偏差的新方法。另一方面，为了实时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种试样内靶分析物的分析方法，其包括：/n获取与上述靶分析物有关的数据集的步骤，上述数据集从利用信号发生单元的信号发生反应获取，包含具有循环号码及信号值的多个数据位置；/n校准上述数据集的步骤；/n生成对于校准的上述数据集的非线性函数的步骤；/n确定对于校准的上述数据集的上述非线性函数的匹配准确度的步骤；以及/n利用上述匹配准确度来确定上述试样内靶分析物的存在或不存在的步骤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170928 KR 10-2017-0125908;20171020 KR 10-2017-011.一种试样内靶分析物的分析方法，其包括：
获取与上述靶分析物有关的数据集的步骤，上述数据集从利用信号发生单元的信号发生反应获取，包含具有循环号码及信号值的多个数据位置；
校准上述数据集的步骤；
生成对于校准的上述数据集的非线性函数的步骤；
确定对于校准的上述数据集的上述非线性函数的匹配准确度的步骤；以及
利用上述匹配准确度来确定上述试样内靶分析物的存在或不存在的步骤。


2.根据权利要求1所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述非线性函数为s型函数。


3.根据权利要求2所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述s型函数为包括通过以下数学式3表示的4个参数的s型函数，
数学式3



在上述数学式中，f(x)作为匹配函数，表示s型函数，x为上述信号发生反应的循环号，而且，a1、a2、a3及a4为分别表示上述s型函数的参数。


4.根据权利要求1所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述匹配准确度为与校准的上述数据集有关的上述非线性函数的x2值或R2值。


5.根据权利要求1所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述试样内靶分析物的存在或不存在的确定通过对上述匹配准确度与上述匹配准确度有关阈值进行比较来实施。


6.根据权利要求5所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述试样内靶分析物的存在或不存在的确定如下实施，即，对上述匹配准确度与上述匹配准确度有关阈值进行比较，判断上述匹配准确度是否大于上述阈值来实施。


7.根据权利要求1所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述试样内靶分析物的存在或不存在的确定追加利用选自由(i)上述数据集、校准的上述数据集或上述非线性函数的变位及(ii)上述非线性函数的最大斜率组成的组中的最小一个参数来实施。


8.根据权利要求3所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述试样内靶分析物的存在或不存在的确定追加利用选自由(i)包含上述数据集、校准的上述数据集或上述4个参数的s型函数的变位及(ii)包含上述4个参数的s型函数的最大斜率及a4组成的组中的最小一个参数来实施。


9.根据权利要求1所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述靶分析物为靶核酸分子。


10.根据权利要求9所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述信号发生反应为通过上述靶核酸分子的扩增或没有扩增地扩增信号值的过程。


11.根据权利要求10所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述信号发生单元生成依赖于二聚物的形成的信号。


12.根据权利要求10所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述信号发生单元生成依赖于检测寡核苷酸的切割的信号。


13.根据权利要求1所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述数据集的校准步骤包括：
利用(i)在基准循环中的信号值或(ii)在上述基准循环中的上述信号值的变形值来生成标准化系数的步骤；以及
将上述标准化系数适用于上述数据集的信号值来生成校准的上述数据集的步骤。


14.根据权利要求13所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述信号发生反应包含在不同的反应环境中对于相同靶分析物的多个信号发生反应，上述数据集为多个数据集，多个上述数据集从多个上述信号发生反应的多个集获取，上述基准循环或上述基准循环与上述基准值相同地适用于多个上述数据集。


15.根据权利要求14所述的试样内靶分析物的分析方法，其中多个上述信号发生反应在包括不同的多个设备、不同的多个反应管或容器、不同的多个试样、不同量的靶分析物或不同的多个引物或探针的其他反应环境中实施。


16.根据权利要求13所述的试样内靶分析物的分析方法，其中校准的上述数据集(i)通过在上述数据集适用上述标准化系数来生成标准化的数据集，或者(ii)对上述数据集或上述标准化的数据集进行基线来生成。


17.根据权利要求1所述的试样内靶分析物的分析方法，其中所述数据集包含(i)作为在相对高的检测温度条件下检测的信号的与第一靶核酸序列有关的信号和/或(ii)与从在相对低的检测温度条件下检测的信号提取的第二靶核酸序列有关的信号，而且，上述第一靶核酸序列及上述第二靶核酸序列从一个反应容器检测。


18.根据权利要求17所述的试样内靶分析物的分析方法，其中与上述第一靶核酸序列有关的信号及与上述第二靶核酸序列有关的信号通过如下的步骤获取：
步骤(a)，在上述反应容器中，与上述试样一同培养能够发生与上述第一靶核酸序列有关的信号的第一信号发生单元及能够发生与上述第二靶核酸序列有关的信号的...

【专利技术属性】
技术研发人员：金英旭，朴永用，高成文，李荣祚，H·B·李，
申请(专利权)人：SEEGENE株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR