肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法技术

本发明专利技术公开了一套检测小鼠肠道分节丝状菌SFB鞭毛蛋白的方法与应用，包括PCR方法、蛋白质变性电泳与免疫印迹方法(SDS‑PAGE‑Western blotting)、细菌原位杂交结合免疫组化方法(FISH+IHC)。所述PCR方法为，设计合成了一对能特异性扩增SFB鞭毛蛋白Flic3基因的引物，使用该引物对样品DNA进行PCR扩增后，可以在凝胶电泳后检测到与Flic3基因片段大小一致的DNA条带。所述蛋白质变性电泳与免疫印迹方法为，成功制备了兔抗SFB Flic3鞭毛蛋白的多克隆抗体，并可以使用该蛋白对样品中是否存在SFB Flic3鞭毛蛋白进行检测。所述细菌原位杂交结合免疫组化方法为使用SFB16S rRNA基因特异常性探针和兔抗SFB Flic3鞭毛蛋白多克隆抗体检测SFB鞭毛蛋白的表达情况、SFB细菌的形态及SFB与肠上皮的相互作用情况。本发明专利技术所涉及的检测方法具有快速、直观和表象的优点。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种鞭毛蛋白的检测，特别设计一种PCR方法检测肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的方法。(二)
技术介绍
肠道分节丝状菌(SFB)是一种革兰氏阳性菌，广泛定殖于包括人体在内的脊椎和非脊椎动物肠道中。SFB定殖对宿主的免疫系统意义非常重大。通过小鼠动物实验得知，SFB能刺激宿主sIgA的释放，调节T细胞的分化与平衡，促进免疫系统的成熟等。同时，SFB与宿主自身免疫疾病的发生发展相关。但到目前为止，对SFB如何与宿主细胞相互作用还知之甚少。细菌鞭毛基因是影响细菌定殖和宿主免疫调控反应的重要功能基因。很多肠道细菌，如沙门氏菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌均具有表达分泌鞭毛蛋白的能力。当鞭毛蛋白粘附到肠上皮基底部后可以启动天然免疫反应和鞭毛蛋白介导的促炎反应。同时，也有研究表明肠道细菌编码的鞭毛蛋白具有调节宿主体内CD4T细胞分化的功能。鉴于细菌鞭毛蛋白的重要生理功能，推测SFB鞭毛蛋白可能与其特异性定殖和免疫调控功能相关。SFB全基因组测序分析也发现，SFB基因组编码46个鞭毛和趋化相关蛋白，具有一套完整的生物合成鞭毛蛋白的基因。比较基因组学分析表明，虽然与SFB分类相近的大部分梭菌也本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法，其特征在于所述方法为：提取待测肠道内容物DNA为模板，以SFB FliC3‑F和SFB FliC3‑R为引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增产物长度与mflic3基因长度相同，则待测肠道含有肠道分节丝状菌鞭毛蛋白；所述mflic3基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；SFB FliC3‑F:5′‑ATG ATA ATT AAY CAC AAT ATG AAT G‑3′，SFB FliC3‑R:5′‑TCT YAA KAT WGA AAG WAC TTG TTG T‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法，其特征在于所述方法为：提取待测肠道内容物DNA为模板，以SFB FliC3-F和SFB FliC3-R为引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增产物长度与mflic3基因长度相同，则待测肠道含有肠道分节丝状菌鞭毛蛋白；所述mflic3基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；SFB FliC3-F:5′-ATG ATA ATT AAY CAC AAT ATG AAT G-3′，SFB FliC3-R:5′-TCT YAA KAT WGA AAG WAC TTG TTG T-3′。2.如权利要求1所述肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法，其特征在于所述PCR扩增体系为25μL：2.5μL 2.5mmol dNTP，2.5μL 10×EX Taq buffer，10μmol上、下游引物各1μL，0.3μL 5U/μL EX Taq polymerase和100ng模版，补水至25μL。3.如权利要求1所述肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法，其特征在于所述PCR扩增程序为94℃45s 1个循环；94℃30s，50℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min，1个循环。4.一种肠道分节丝状...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈华海，尹业师，王欣，项春生，
申请(专利权)人：浙江大学，浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33