本发明专利技术公开了一种环境水体中人类肠道病毒与非人类肠道病毒的含量检测方法。在已建立环境水体中肠道病毒定量检测方法的基础上，选择针对人类肠道病毒的引物和探针，制备重组质粒作为标准品，建立了定量检测人类肠道病毒的实时荧光定量PCR反应体系，定量检测环境水体中的人类肠道病毒含量和肠道病毒含量，进一步确定非人类肠道病毒的分布情况。该方法具有良好的特异性，灵敏度高，可对人类肠道病毒，肠道病毒进行准确定量并确立环境水体中人类肠道病毒与非人类肠道病毒的关系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于环境水体质量的检测
，具体涉及一种。
技术介绍
肠道病毒是广泛存在于水源水及污染水中，不断引起水媒病毒传染病的暴发流行。病毒的检测方法主要有组织培养法、免疫学方法、分子生物学方法等。其中，组织培养法培养周期长，有些病毒缺乏敏感的细胞系来培养或无明显细胞病变效应；免疫学检测方法需要较高浓度的病毒样品，环境水样浓缩后，也不易达到所需浓度；分子生物学方法多利用核酸的检测，因其检测时间短，检测限低灵敏度高，精确度高，已得到广泛的应用。环境水体中肠道病毒属宿主迥异，种类复杂浓度低，现有的关于环境水体中肠道 病毒的PCR检测方法大多是定性或定量的检测总肠道病毒，来源于人类分泌物或排泄物的肠道病毒的检测很少有研究涉及。因环境水体水质复杂同时存在很多PCR反应抑制剂和其他杂质，导致现有检测方法存在灵敏度不够高、受杂质干扰影响较大、无法准确定量的缺点。目前还没有科学的用于对环境水体中人类肠道病毒和非人类肠道病毒含量进行检测的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种。为此，本专利技术提供的按下述步骤进行步骤一,样品处理(I)样品米集米集待检测水样后于4 C条件下保存；(2)病毒浓缩于V mL的待检测水样中加入质量百分比为8%的聚乙二醇(PEG-6000)和质量百分比为2. 3%的氯化钠(NaCl);接着将待检测水样在100rpm、4°C条件下搅拌12小时；然后将待检测水样在9000g，4°C条件下离心30分钟，弃上清液，用ImL超纯水重悬沉淀得到病毒浓缩液，其中50 < V < 250 ;(3) RNA提取使用RNA提取试剂盒从病毒浓缩液中提取RNA ；(4)逆转录将5 μ L 的RNA、2 μ L 的 5xgDNA Eraser Buffer、I μ L 的 5xgDNA EraserBuffer和2 μ L的RNase Free dH20在42°C条件下反应2min得到反应液，将该反应液与4 μ L 的5xPrimeScript* Buffer> I μ L 的PrinieScript**' RT Enzyme Mix、I μ L 的 RT PrimerMix和4 μ L的RNase Free dH20混合进行如下反应先在37°C条件下反应15min ;接着在85°C条件下反应5s ;得到cDNA，并将所得cDNA在_80°C条件下保存；步骤二，标准品制备(I)第一轮PCR扩增以步骤一获得的cDNA为模板，利用上游引物EVR-Fl和下游引物EVR-Rl进行PCR扩增，得到第一轮扩增后的PCR产物，其中上游引物EVR-Fl的核苷酸序列为5’ -CCCCTGAATGCGGCTAATCC-3’ ；下游引物EVR-Rl的核苷酸序列为5， -CAATTGTCACCATAAGCAGCCA-3，；(2 )第二轮PCR扩增以第一轮扩增后的PCR产物为模板，利用上游引物EVR-F2和下游引物EVR-R2进行PCR扩增，得到第二轮扩增后的PCR产物，其中上游引物EVR-F2的核苷酸序列为5， -GTAACGGGCAACTCTGCAGC-3，；下游引物EVR-R2的核苷酸序列为 5， -ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3，；(3)将所得的第二轮扩增后的PCR产物电泳胶纯化回收目的片段，得到目的片段产物，该目的片段产物的长度为m (bp)；(4)首先将目的片段产物与pMD19-T载体连接转化至大肠杆菌DH5a中，筛选出转化进插入目的片段的载体的菌落，将该阳性菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中于37°C条件下培养12 16小时得到菌液，其中卡那霉素的质量浓度为50μ g/mL ;然后用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒；接着采用双脱氧终止法对得到的质粒的核苷酸序列进行测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，当所测得的核苷酸序列与人类肠道病毒基因相似度大于等于90%时，提取的质粒为标准品；当所测得的核酸序列与人类肠道病毒基因相似度小于90%时，重复步骤(4)，直至提取的质粒为标准品；(5 )检测标准品的OD26tl值η ；(6)利用(式I)计算标准品浓度C (copies/ μ L)权利要求1.一种，其特征在于，方法按下述步骤进行 步骤一，样品处理 (1)样品米集米集待检测水样后于4C条件下保存； (2)病毒浓缩于VmL的待检测水样中加入质量百分比为8%的聚乙二醇(PEG-6000)和质量百分比为2. 3%的氯化钠(NaCl);接着将待检测水样在100rpm、4°C条件下搅拌12小时；然后将待检测水样在9000g，4°C条件下离心30分钟，弃上清液，用ImL超纯水重悬沉淀得到病毒浓缩液，其中50≤V≤250 ; (3)RNA提取使用RNA提取试剂盒从病毒浓缩液中提取RNA ；(4)逆转录将5 μ L 的 RNA、2 μ L 的 5X gDNA Eraser Buffer、I μ L 的 5X gDNA EraserBuffer和2 μ L的RNase Free dH20在42°C条件下反应2min得到反应液，将该反应液与.4 μ L 的5XPrimeSerifJt* Buffer、I μ L 的PrimeScript RT Enzyme Mix、I μ L 的 RT PrimerMix和4 μ L的RNase Free dH20混合进行如下反应先在37°C条件下反应15min ;接着在85°C条件下反应5s ;得到cDNA，并将所得cDNA在_80°C条件下保存； 步骤二，标准品制备 (1)第一轮PCR扩增以步骤一获得的cDNA为模板，利用上游引物EVR-Fl和下游引物EVR-Rl进行PCR扩增，得到第一轮扩增后的PCR产物，其中 上游引物EVR-Fl的核苷酸序列为5’ -CCCCTGAATGCGGCTAATCC-3’ ； 下游引物EVR-Rl的核苷酸序列为5’ -CAATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’ ； (2)第二轮PCR扩增以第一轮扩增后的PCR产物为模板，利用上游引物EVR-F2和下游引物EVR-R2进行PCR扩增，得到第二轮扩增后的PCR产物，其中 上游引物EVR-F2的核苷酸序列为5’ -GTAACGGGCAACTCTGCAGC-3’ ； 下游引物EVR-R2的核苷酸序列为5’ -ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’ ； (3)将所得的第二轮扩增后的PCR产物电泳胶纯化回收目的片段，得到目的片段产物，该目的片段产物的长度为m (bp)； (4)首先将目的片段产物与PMD19-T载体连接转化至大肠杆菌DH5α中，筛选出转化进插入目的片段的载体的菌落，将该阳性菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中于37°C条件下培养12 16小时得到菌液，其中卡那霉素的质量浓度为50μ g/mL ;然后用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒；接着采用双脱氧终止法对得到的质粒的核苷酸序列进行测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，当所测得的核苷酸序列与人类肠道病毒基因相似度大于等于90%时，提取的质粒为标准品；当所测得的核酸序列与人类肠道病毒基因相似度小于90%时，重复步骤(4)，直至提取的质粒为标准品； 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种环境水体中人类肠道病毒与非人类肠道病毒含量检测方法，其特征在于，方法按下述步骤进行：步骤一，样品处理：（1）样品采集：采集待检测水样后于4℃条件下保存；（2）病毒浓缩：于V？mL的待检测水样中加入质量百分比为8%的聚乙二醇（PEG？6000）和质量百分比为2.3%的氯化钠（NaCl）；接着将待检测水样在100rpm、4℃条件下搅拌12小时；然后将待检测水样在9000g，4℃条件下离心30分钟，弃上清液，用1mL超纯水重悬沉淀得到病毒浓缩液，其中50≤V≤250；（3）RNA提取：使用RNA提取试剂盒从病毒浓缩液中提取RNA；（4）逆转录：将5μL的RNA、2μL的5×gDNA？Eraser？Buffer、1μL的5×gDNA？Eraser？Buffer和2μL的RNase？Free？dH2O在42℃条件下反应2min得到反应液，将该反应液与4μL的Buffer、1μL的RT？Enzyme？Mix、1μL的RT？Primer？Mix和4μL的RNase？Free？dH2O混合进行如下反应：先在37℃条件下反应15min；接着在85℃条件下反应5s；得到cDNA，并将所得cDNA在？80℃条件下保存；步骤二，标准品制备：（1）第一轮PCR扩增：以步骤一获得的cDNA为模板，利用上游引物EVR？F1和下游引物EVR？R1进行PCR扩增，得到第一轮扩增后的PCR产物，其中：上游引物EVR？F1的核苷酸序列为：5’？CCCCTGAATGCGGCTAATCC？3’；下游引物EVR？R1的核苷酸序列为：5’？CAATTGTCACCATAAGCAGCCA？3’；（2）第二轮PCR扩增：以第一轮扩增后的PCR产物为模板，利用上游引物EVR？F2和下游引物EVR？R2进行PCR扩增，得到第二轮扩增后的PCR产物，其中：上游引物EVR？F2的核苷酸序列为：5’？GTAACGGGCAACTCTGCAGC？3’；下游引物EVR？R2的核苷酸序列为：5’？ATTGTCACCATAAGCAGCCA？3’；（3）将所得的第二轮扩增后的PCR产物电泳胶纯化回收目的片段，得到目的片段产物，该目的片段产物的长度为m（bp）；（4）首先将目的片段产物与pMD19？T载体连接转化至大肠杆菌DH5α中，筛选出转化进插入目的片段的载体的菌落，将该阳性菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中于37℃条件下培养12~16小时得到菌液，其中卡那霉素的质量浓度为50μg/mL；然后用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒；接着采用双脱氧终止法对得到的质粒的核苷酸序列进行测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，当所测得的核苷酸序列与人类肠道病毒基因相似度大于等于90%时，提取的质粒为标准品；当所测得的核酸序列与人类肠道病毒基因相似度小于90%时，重复步骤（4），直至提取的质粒为标准品；（5）检测标准品的OD260值n；（6）利用（式1）计算标准品浓度C（copies/μL）：C=n×50×10-9(2962+m)×2×330×6.02×1023（式1）式1中：2962为pMD19？T载体的长度，bp；1OD260=50μg/mL的双链DNA；330为1碱基的分子量，g/mol；6.02×1023为阿伏伽德罗常数，NA；（7）配制c×10？4copies/μL、c×10？5copies/μL、c×10？6copies/μL、c×10？7copies/μL、c×10？8copies/μL、c×10？9copies/μL和c×10？10copies/μL七个浓度梯度的标准品溶液样品，利用实时荧光定量PCR分别检测各浓度梯度样品的Ct值和初始模版量x（copies），接着利用测得的七组Ct？x进行线性回归分析，得到标准曲线方程：Ct＝alogx+b？？？（式2）式2中：a和b为标准曲线方程的系数；步骤三，定量检测：（1）将10μL的2×Premix？EX？TaqTM？Mix、200nM的上游引物EVR？F2、200nM的下游引物EVR？R2、400nM的TaqMan探针EVR？P、0.4μL的50×ROXReference？DyeⅡ和2μL步骤一所获得的cDNA混合，接着用无菌超纯水补足至20μL，在实时定量PCR仪上进行扩增，检测步骤一所获得的cDNA的Ct值Ct0，同时以无菌超纯水作为阴性对照；其中的PCR反应条件为：①95℃预变性2min；②扩增循环45次：95℃，15s；60℃，60s；所述TaqMan探...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周进宏，王晓昌，张崇淼，船水尚行，佐野大辅，
申请(专利权)人：西安建筑科技大学，
类型：发明
国别省市：
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