本发明专利技术涉及一种快速检测鸭出血性卵巢炎病毒（Duck?hemorrhagic?ovaritis?virus,DHOV）的RT-PCR法。作为一种非常具有特异性、敏感性及重复性的畜禽疫病快速检测技术，RT-PCR方法已广泛应用于多种黄病毒属特异性诊断，但通常检测的靶基因主要是NS5。本发明专利技术是在现已公开发表的51个具有代表性的黄病毒株的E基因序列比较基础上，设计了通用性的针对黄病毒E基因核酸序列的特异性引物对，建立了RT-PCR方法。该方法具有较好的特异性,能最低检测到20pg黄病毒,也具有极好的重复性。本发明专利技术建立的DHOV?RT-PCR检测方法为该病的快速检测提供了一种可靠方法，这对于本病的实验室检测、诊断、流行病学调查及病原遗传演化研究提供了较好的方法基础，具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一对能快速检测鸭出血性卵巢炎病毒的RT-PCR法。属兽用生物制品
技术介绍
2010年4月以来，我国浙江、江苏、山东、福建、河北、北京等省份的蛋鸭发生一种以产蛋率急速下降、甚至停产及不同程度死亡为特征的疫病，俗称蛋鸭产蛋骤降、卵巢出血症，亦称为“鸭黄病毒感染”，现命名为鸭出血性卵巢炎(Duckhemorrhagi covaritis, DH0) 0各品种蛋鸭、种鸭、鹅等家禽均有发生，但主要见于开产蛋鸭。产蛋鸭发病后出现长时间(40— 60d)的产蛋率低下，恢复后所产种蛋的受精率和孵化率出现下降。发病鸭群采食量显著下降，拉绿色稀便，精神沉郁，扎堆，羽毛逆立，眼球深陷，目光呆滞，体重 减轻。少量病鸭出现站立不稳、震颤，行走困难和姿势异常。主要病变为出血性卵巢炎、间质性肝炎和非化脓性脑炎。该病近期成为危害中国养鸭业的重要疫病之一。产蛋率高的鸭群患病后4 5(1从产蛋高峰或高产蛋率迅速下降至209Γ30%，严重的于发病后7d左右停产；刚开产蛋鸭产蛋率上升缓慢或减蛋，长时间低产蛋率或无产蛋高峰出现。不同地区、不同品种鸭群发病率高低不一，群发病率几乎100%，病死率0°/Γ 2%。由于是新发传染病，人们对DHOV及由其感染导致的发病认识很不充分。众所周知黄病毒有3种结构蛋白(C、prM和E蛋白)与7种非结构蛋白(NSl、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)，其中，E蛋白表面的抗原表位与病毒对宿主细胞的嗜性、受体结合和致病性有关。
技术实现思路
通常黄病毒RT-PCR的检测靶基因为NS5。而本专利技术的目的是本专利技术通过检测DHOV的E基因作为靶基因，对鸭出血性卵巢炎的病毒和有关样品进行快速检测，同时可基于检测开展对该病的流行病学调查和病原遗传演化研究。本专利技术采用的技术方案如下(I)用常规病毒核酸提取方法提取疑似鸭出血性卵巢炎病例的肝脏、卵巢组织样品中的可能含有的DHOV总RNA ；(2) RT反应20 μ L体系，各组分包括DHOV总RNA 3 μ L、AFVTR I μ L、5X反转录Buffer 4μ L、含Mg2+的dNTP 4 μ L、RNA酶抑制剂O. 5 μ L、反转录酶O. 5 μ L，最后用灭菌双蒸水或灭菌DEPC水补足反应体积至20 μ L，瞬时离心后室温平衡5 lOmin，在42°C保温I.5h，即可获得用于PCR扩增的cDNA ；(3)PCR扩增反应 25 μ L体系，各组分包括 10XPCR Buffer2. 5 μ L、含Mg2+的 dNTP2μ L、引物 AFVTF 和 AFVTR 各 O. 5 μ L、rTaq 酶 O. 5 μ L、cDNA 3 μ L、加灭菌双蒸水至 25 μ L。反应程序为95°C变性5min，32X (94°C 45s,55°C 45s, 72°C 50s)个循环反应，最后72°C延伸IOmin ;其中AFVTF和AFVTR是针对黄病毒基因组E基因设计的一对引物，这对引物的序列为AFVTF :5’-TTACCATGGACAGGGTCATCA-3’AFVTR :5’-TCCAATTGTGCTCCCACTTCT-3’ ；(4)电泳检测PCR反应结束后，取5 10 μ L扩增产物用1%的琼脂糖凝胶，在100V、45飞Omin条件下进行电泳，进行观察、照相和记录结果。具体实施方法I. RT-PCR方法的建立(I)引物设计登录GenBank，分别下载了 51个具有代表性的黄病毒全基因组序列及5个禽源黄病毒株的全部或部分E基因序列，经DNAstar7. O软件分析后，利用Primer5. O软件自主设计了 I对检测引物(扩增片段约549bp,见序列3)AFVTF : 5’-TTACCATGGACAGGGTCATCA-3’，AFVTR : 5’-TCCAATTGTGCTCCCACTTCT-3’， 以上引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。(2)对照用毒株DHOV-JN株(本专利技术人分离和鉴定)作为阳性对照；禽流感病毒(Avianinfluenzavirus, AIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)、减蛋综合症病毒(Chickenegg down syndrome virus, EDSV)、鸭肝炎病毒(Duck hepatitisvirus, DHV)、传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)、传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus, IBV)、番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duckreovirusis, MDRV)以及禽网状内皮增生症病毒(Avian reticuloendotheliosis virus, REV),作为参考病毒毒株,为本专利技术人所在单位保存并提供。(3)样本的处理共16份样品，采集自山东省某发病鸭场，每份样品主要包括鸭的肝脏、卵巢组织等。将每份样品剪取5. Og组织，加入少量的MEM (含青霉素、链霉素1000U/mL)，研磨至糊状，再加入4倍体积的MEM稀释成悬浊液，样品在-80°C和室温反复冻融3次，再经4°C、12000rpm/min离心lOmin，收集上清液分装后_80°C冻存备用。(4)病毒核酸的提取用常规的酚氯仿法/或用TRIzol/或市售RNA提取试剂盒提取样品中的病毒核。酸如按照Invitrogen公司生产的Trizol LS Reagent说明书分别提取上述16份样品中可能含有的DHOV总RNA，_80°C保存备用。(5 ) RT-PCR反应体系及程序RT反应用20 μ L体系，取鸭出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic ovaritisvirus，DH0V) DHOV-JN株(本专利技术人分离和鉴定，该株病毒已于2012年3月22日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏号为CGMCC No. 5907)总RNA3 μ L，加入下游引物AFVTR I μ L、dNTP4y L、Rnase-InhibitorO. 5μ L、AMV0. 5μ L、5XAMV Buffer4 μ L，加 DEPC H2O 至 20 μ L，42°C Ih 即得 cDNA 模板。PCR 反应用 25 μ L 体系10 X PCR Buffer 2. 5 μ L, dNTPs 2yL、上下游引物各0.5 μ L、rTaq 0· 5 μ L、cDNA 3 μ L、加灭菌水至25 μ L。通过梯度PCR，筛选出最佳的PCR退火温度为55°C 45s，具体反应条件是RT反应用20 yL体系，取DHOV-JN株RNA作模板3 μ L，加入下游引物I μ L、dNTP4 μ L、Rnase-Inhibitor O. 5 μ L、AMV0. 5 μ L、5 X AMV Buffer 4 μ L，加 DEPC H2O 至 20 μ L，42°C Ih即得cDNA模板。PCR反应用25μ L体系10XPCR Buffer2. 5 μ L、dNTPs 2yL、上下游引物各 0· 5 μ L、rTaq 0· 5 μ L、cDNA 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测鸭出血性卵巢炎病毒的RT？PCR法，其特征在于该方法为：（1）用常规病毒核酸提取方法提取疑似鸭出血性卵巢炎病例的肝脏、卵巢组织样品中的可能含有的DHOV总RNA；（2）RT（反转录）反应20μL体系，各组分包括DHOV总RNA？3μL、AFVTR1μL、5×反转录Buffer？4μL、含Mg2+的dNTP？4μL、RNA酶抑制剂0.5μL、反转录酶0.5μL，最后用灭菌双蒸水或灭菌DEPC水补足反应体积至20μL，瞬时离心后室温平衡5~10min，在42℃保温1.5h，即可获得用于PCR扩增的cDNA；（3）PCR（聚合酶链式扩增）扩增反应25μL体系，各组分包括10×PCR？Buffer2.5μL、含Mg2+的dNTP？2μL、引物AFVTF和AFVTR各0.5μL、rTaq酶0.5μL、cDNA？3μL、加灭菌双蒸水至25μL。反应程序为95℃变性5min，32×（94℃45s、55℃45s，72℃50s）个循环反应，最后72℃延伸10min；其中AFVTF和AFVTR是针对黄病毒基因组E基因设计的一对引物，这对引物的序列为AFVTF：5“？TTACCATGGACAGGGTCATCA？3“AFVTR：5“？TCCAATTGTGCTCCCACTTCT？3′；（4）电泳检测？？PCR反应结束后，取5~10μL扩增产物用1%的琼脂糖凝胶，在100V、45~60min条件下进行电泳，进行观察、照相和记录结果。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹敏，吴发兴，刘新文，胡潇，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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