一种鸭坦布苏病毒病血凝抑制试验抗原及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种鸭坦布苏病毒病血凝抑制试验抗原及其制备方法。本发明专利技术所述的鸭出血性卵巢炎病毒HB株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC V201122。本毒株包含特定基因序列，其在GenBank登录号为JF523187。本发明专利技术利用该毒株接种乳鼠增殖病毒、经去除血凝抑制非特异物质（脂蛋白）、灭活和加入保护剂等工艺制备成鸭坦布苏病毒病血凝抑制试验抗原。本发明专利技术还公开了利用鸭坦布苏病毒制备血凝抑制试验抗原的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鸭坦布苏病毒病血凝抑制试验抗原及其制备方法，涉及生物工程及免疫学领域。
技术介绍
鸭坦布苏病毒病为2010年发生的一种新发或突发传染病，主要临床特征为产蛋鸭产蛋量突然下降和商品肉鸭死淘率显著增加，自然感染和人工感染病例的主要大体病变为卵泡变形、充血、出血及脾脏体积变化(感染早期脾脏肿大，后期脾脏缩小)和颜色变黑。主要的组织学病变为淋巴细胞和网状细胞活化增生，疫情流行初期，根据主要的病理变化，将该病暂命名为“鸭出血性卵巢炎”。随后经过病毒分离鉴定和DNA序列同源性分析结果表明，引起上述鸭疫情的病毒为一种虫媒病毒，属于黄病毒科黄病毒属、Ntaya病毒群，与Tembusu病毒亲缘关系最近(Caoetal.,2011；Suetal.,2011；Yanetal.,2011)。2011年中国畜牧兽医学会首届水禽疫病防控研讨会将该病名称统一为“鸭坦布苏病毒病”，但到目前为止，尚未有国家层面关于该病命名的统一规定或者提法。值得一提的是，现有文献资料表明，鸭黄病毒病可能最早于1995年出现就在河北省石家庄、邯郸等地。温立斌等首次从腹泻和腿麻痹的病鸭肝脏、脾脏中分离到一株病毒，该病毒呈球形，大小约30nm，有囊膜的单链RNA病毒，鉴定结论为分离的病毒似乎属于黄病毒科病毒，并将该病初步命名为“鸭病毒性脑炎”。Tembusu病毒首次于1968-1970年在Sarawak地区的蚊子体内分离到，曾一度认为家禽可能是病毒的自然宿主(Plattetal.,1975)。Tembusu病毒分别于1982和1992年在泰国北部日本脑炎流行地区蚊子体内分离到(Leakeetal.,1986；Pandeyetal.,1999)。2000年，研究人员报道了一种新的名为Sitiawan的黄病毒感染鸡后能够引起鸡生长发育受阻(Konoetal.,2000)，Sitiawan病毒与Tembusu病毒核酸的同源性为92％。中国从鸭体内分离到的Tembusu病毒与Bagaza病毒的核酸高度同源(Tangetal.,2012；Yunetal.,2012)。在控制疫情所采取的手段和措施中，疫情监测、血清学诊断、疫苗免疫效果评价和实验动物筛选等工作尤为重要。到目前为止，检测鸭坦布苏病毒抗体的方法有血清中和试验(SerumNeutralizationTest，SNT)、血凝抑制试验(HemagglutinationInhibition，HI)和酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA)等，其中HI试验具有敏感、特异、简便、成本低、检测发病鸭群阳性率较高和可用于早期诊断的优势，是抗体检测的首选方法。HI试验用于流行病学调查、临床诊断和疫苗免疫效力评价等，对控制鸭坦布苏病毒病疫情起关键作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有抗体检测技术中没有血凝抑制试验抗原和方法的不足，提供一种鸭坦布苏病毒病血凝抑制试验抗原及制备方法，使其提供一种准确、灵敏、特异、经济和操作简单的抗体检测试剂和方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种由鸭坦布苏病毒制备的血凝抑制试验抗原。进一步的，鸭出血性卵巢炎病毒HB株，保藏号为CCTCCV201122，于2011年7月1日保藏在中国典型培养物保藏中，保藏地址为：中国武汉大学，武汉。使用所述抗原制备的药品、试剂及试剂盒。所述抗原的制备方法，所述制备方法包括以下制备步骤：1)将鸭胚接种鸭坦布苏病毒后制备鸭胚基础毒种，鸭胚传代不超过3代；2)将鸭胚基础毒种接种乳鼠取鼠脑制备HB株毒种，鼠脑传代不超过3代；3)将HB株病毒接种2～4日龄乳鼠或C6/36细胞获得病毒液；4)灭活；5)加入保护剂。进一步的，步骤1)的具体操作方法为：取接种鸭坦布苏病毒后死亡鸭胚的尿囊液和胚体，捣碎，稀释，冻融，离心，取上清夜，测定半数致死量ELD50，并进行无菌检验，将病毒含量不低于106.0ELD50/0.1ml且无菌检验合格的毒种作为鸭胚基础毒种。进一步的，步骤2)的具体操作方法为：利用鸭胚基础毒种，以100ELD50/0.1ml的剂量经脑接种2～4日龄乳鼠，收获精神沉郁和震颤临床症状明显的鼠脑，研磨，稀释，冻融，离心，取上清夜，测定半数致死量ELD50，并进行无菌检验，将半数致死量不低于106.0ELD50/0.1ml，且无菌检验合格的毒种作为基础HB株毒种。进一步的，步骤3)HB株病毒接种2～4日龄乳鼠，取出精神沉郁、震颤等临床症状明显的鼠脑组织，去除非特异血凝抑制物获得病毒液，所述病毒液病毒含量不低于106.0ELD50/0.1ml。进一步的，去除非特异血凝抑制剂物的方法为：脑组织融化后加入终浓度为8.5％的无菌蔗糖，匀浆，在搅动状态下，将匀浆物逐滴加入丙酮中，离心去除上清液，收集沉淀冷冻干燥，加入无菌生理盐水溶解冷冻干燥后的沉淀，5000～10000g离心30～60分钟，收集上清液。进一步的，步骤3)中HB株病毒接种C6/36细胞系，当细胞出现75％CPE时收集上清液浓缩获得病毒液，所述病毒液病毒含量不低于106.0TCID50/0.1ml。进一步的，步骤4)的具体操作为：向上述病毒液中加入甲醛溶液，灭活2～3天，所述甲醛溶液浓度为37～40％，加入甲醛浓度为0.02％～0.2％；步骤5)的具体操作为：加入明胶冻干保护剂或者甘油，制备成冻干固态抗原或者液态稳定抗原。本专利技术的有益效果是：本专利技术从感染鸭坦布苏病毒的病鸭中分离鸭坦布苏病毒(HB株)，将分离病毒脑内或腹腔接种乳鼠(或C6/36细胞)培养，收获感染脑组织(或细胞液)，其中经鼠脑培养的病毒经蔗糖－丙酮处理，甲醛灭活后加适宜保护剂制成。用于鸭坦布苏病毒病抗体的检测。该抗原具有以下特点：稳定性:2～8℃存放24个月，HA效价仍不低于1:128。特异性:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价≥1:10)，对鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价﹤1:10)。敏感性:可检测出疫苗免疫2～3周和病毒感染4～5天后鸭和鹅血清中的HI抗体。本专利技术的创新点：国内外尚未见有鸭坦布苏病毒病血凝抑制试验抗原的研究报道，通过我们多年和系统研究结果表明，研制的抗原稳定、特异和敏感，弥补了该体外诊断试剂的空白。本专利技术的技术关键点：(1)明确的基础毒种和生产毒种的代次；(2)去除病毒血凝抑制物质使病毒能够凝集红血球的工艺；(3)灭活具有感染活性病毒的工艺；(4)抗原的保存状态(液态或者冻干)。具体实施方式实施例1制备抗原用原材料：1)敏感(选择2～4日龄封闭群或近交系)乳鼠，经脑内途径、按照25μl/只(约含100ELD50)的剂量接种鸭坦布苏病毒，观察至144小时，乳鼠出现精神沉郁和震颤等临床症状，乳鼠发病率和死亡率应大于90％。2)鸭坦布苏病毒，属于黄病毒科成员，包含特定基因序列，其在GenB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由鸭坦布苏病毒制备的血凝抑制试验抗原。

【技术特征摘要】
1.一种由鸭坦布苏病毒制备的血凝抑制试验抗原。
2.根据权利要求1所述抗原，其特征在于：鸭出血性卵巢炎病毒HB株，保藏号为CCTCCV201122，于2011年7月1日保藏在中国典型培养物保藏中。
3.使用权利要求1或2所述抗原制备的药品、试剂及试剂盒。
4.权利要求1所述抗原的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下制备步骤：1)将鸭胚接种鸭坦布苏病毒后制备鸭胚基础毒种，鸭胚传代不超过3代；2)将鸭胚基础毒种接种乳鼠取鼠脑制备HB株毒种，鼠脑传代不超过3代；3)将HB株病毒接种2～4日龄乳鼠或C6/36细胞获得病毒液；4)灭活；5)加入保护剂。
5.根据权利要求4所述抗原的制备方法，其特征在于：步骤1)的具体操作方法为：取接种鸭坦布苏病毒后死亡鸭胚的尿囊液和胚体，捣碎，稀释，冻融，离心，取上清夜，测定半数致死量ELD50，并进行无菌检验，将病毒含量不低于106.0ELD50/0.1ml且无菌检验合格的毒种作为鸭胚基础毒种。
6.根据权利要求4所述抗原的制备方法，其特征在于：步骤2)的具体操作方法为：利用鸭胚基础毒种，以100ELD50/0.1ml的剂量经脑接种2～4日龄乳鼠，收获精神沉郁和震颤临床症状明显的鼠脑，研磨，稀释，冻融，离心，取上清夜，测定半数致死量ELD50，并进行无菌检验，将半数致死量不低于1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘月焕，林健，王小蕾，杨志远，段会娟，赵际成，刘立新，潘洁，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11