本发明专利技术公开了一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT‑PCR检测方法，属于PEDV病毒的快速检测技术领域。本发明专利技术为了克服病毒分离鉴定、基因测序繁琐、成本高、耗时长的缺点，也为了解决传统RT‑PCR特异性低、灵敏性差的问题；本发明专利技术提供了一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT‑PCR检测方法，该方法操作简便，使用简单，准确率高，特异性强，灵敏度高，既能检测发病动物机体感染PEDV是否为变异毒株，更能定性检测病料中PEDV的存在与否，极大地方便了生产中对PEDV区分是否为变异毒株的检测技术，更丰富了实验室对PEDV研究的内容。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT?PCR检测方法，属于PEDV病毒的快速检测
本专利技术为了克服病毒分离鉴定、基因测序繁琐、成本高、耗时长的缺点，也为了解决传统RT?PCR特异性低、灵敏性差的问题；本专利技术提供了一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT?PCR检测方法，该方法操作简便，使用简单，准确率高，特异性强，灵敏度高，既能检测发病动物机体感染PEDV是否为变异毒株，更能定性检测病料中PEDV的存在与否，极大地方便了生产中对PEDV区分是否为变异毒株的检测技术，更丰富了实验室对PEDV研究的内容。【专利说明】一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测方法
本专利技术属于PEDV病毒的快速检测
，特别涉及一种区分PEDV变异株和经典 株的套式RT-PCR检测方法。
技术介绍
流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒引起的猪 的一种高度接触性传染病，它的主要特征是呕吐、水样腹泻和脱水死亡;各种年龄的猪均易 感，尤其对1~2周龄哺乳仔猪的危害最为严重，发病死亡率可高达90%~100%，Sun R Q等 报道2010年10月开始，中国南方有超过十个省爆发了PEDV，导致超过100万头仔猪死亡，给 养猪业带来了很大的经济损失。早发现、早确诊对该病的防治意义重大。要做到早确诊就需 要在临床上运用一种简便、快速、敏感、特异的诊断方法。 目前，可鉴定PEDV病毒分型的主要方法主要是:病毒的分离鉴定以及测序;分子诊 断技术;聚合酶链式反应(RT-PCR)技术。作为传统的检测方法，PEDV的病原学检测和分子诊 断技术在着许多问题。 PEDV的分离只能在实验室进行，需要较高的技术水平和较先进的实验条件，操作 困难，所需周期长，PEDV目前只可在个别种类的细胞上生长繁殖(如vero细胞，ST细胞)又由 于胰酶对PEDV纤突糖蛋白的切割作用增强了该病毒对Vero细胞的感染力，所以传代须加入 一定浓度的胰酶用于增强病毒在细胞上的适应性，病毒分离期间出现CPE比较困难，并且试 验需进行很长时间。病毒分离以后为了最终确认该组织中的病毒是否变异，还需借助基因 测序并通过遗传进化分析判断其是否发生变异。虽然这种方法可以作为确诊PEDV是否为变 异毒株的最终诊断依据，但此方法不仅操作繁琐，而且成本高、过程复杂、操作时间长，在临 床上区分是否为变异毒株感染实用价值不大。 分子诊断技术的蓬勃发展给TGEV的检测提供了更多的方法，比如:RT_PCR扩增技 术，可设计经典毒株特异性的引物进行PCR扩增后，利用凝胶电泳试验观察片段长度所对应 的位置，确定是否为经典毒株。但在实际操作过程中特异性不强、准确率较低的情况始终存 在，是由于病毒发生变异一般只插入或确实少量的碱基，利用传统RT-PCR很难鉴别病毒的 经典毒株与变异毒株，之后依然要用到基因测序并进行遗传进化分析得到结果，同样操作 繁琐，而且耗费大、耗时多，在临床上也难以加以应用。 所以，一种简便、快速、特异、敏感且对当前流行的经典毒株与变异毒株进行有效 鉴别的检测方法急需出现，而套式RT-PCR具备上述优点，符合使用要求，适合对PEDV的经典 株与变异株在临床上进行快速检测与鉴定。 此套式PCR的原理:据统计，目前爆发的仔猪流行性腹泻很多是由PEDV变异毒株引 起的，Kim S J和H M等指出PEDV只有一个血清型，但是对比其部分S基因发现不同国家和地 区存在多样性。田野等利用世界各地不同分支PEDV的55株做参考，对S抗原表位基因序列进 行进化分析，发现了 S基因的抗原位点发生了 16个碱基的变化。王隆柏等对其7株PEDV流行 毒株的S基因序列比对分析发现，与CV777标准毒株相比，7株PEDV毒株存在多个氨基酸突 变、插入和缺失现象。大量文献表明现在流行的PEDV S基因在58aa处有4个氨基酸(QGVN)的 插入，基于这一原理，根据GenBank中PEDV S基因序列设计合成两对特异性扩增引物，在优 化RT-PCR反应条件的基础上，并完成特异性、敏感性实验及对临床送检样品检测实验，建立 PEDV区分变异毒株与经典毒株的套式RT-PCR检测方法。该套式PCR检测方法使用可识别变 异株的内引物，可以分别鉴定PEDV经典毒株和变异毒株，经典PEDV仅在第一次PCR会产生 749bp的条带，第二次无法产生条带;而变异PEDV在第一次PCR产物中产生760条带，第二次 产生510bp的条带。本实验通过S基因遗传变异分析设计出的套式RT-PCR检测方法，可直接 通过扩增后的产物进行琼脂电泳凝胶试验得到对应目的片段，两次RT-PCR就能快速得出病 毒是否为变异毒株的结果，这将节约大量的时间及测序的成本。目前关于区分PEDV流行毒 株和经典毒株的套式RT-PCR检测技术在国内外还未见报道。经SOOPAT检索，现在并没有设 计针对PEDV S基因引物而对PEDV经典毒株与变异毒株鉴别检测技术的申报和授权。 综上所述，为了克服病毒分离鉴定、基因测序繁琐、成本高、耗时长的缺点，也为了 解决传统RT-PCR特异性低、灵敏性差的问题，同时也为了创造一种更加通用、在临床上更具 有普适性的快速、准确、特异性强的检测区分经典与变异PEDV的方法，本试验研究专利技术了区 分PEDV流行毒株和经典毒株的套式RT-PCR检测技术，该方法操作简便，使用简单，准确率 高，特异性强，灵敏度高，既能检测发病动物机体感染PEDV是否为变异毒株，更能定性检测 病料中PEDV的存在与否，极大地方便了生产中对PEDV区分是否为变异毒株的检测技术，更 丰富了实验室对PEDV研究的内容。
技术实现思路
鉴于当前鉴定PEDV毒株是否为变异毒株只能依靠病毒分离、RT-PCR扩增后测序等 方法，这些方法耗时长，特异性不强，花费高，不能很好快速通过一次试验直接鉴别变异毒 株从而监测猪群发生疫情时的具体致病毒株，本专利技术提供一种区分PEDV变异株和经典株的 套式RT-PCR检测方法。本专利技术的检测方法适用于对PEDV病毒的快速检测，主要应用于鉴别 检测猪流行性腹泻病毒经典毒株与变异毒株、猪场快速诊断PEDV及其流行病学的监测。 本专利技术针对PEDV流行毒株存在多处变异的S基因，利用两对引物进行套式RT-PCR 试验能够快速、准确、高效的对组织病料、细胞培养物等中含有的PEDV进行毒株是否变异的 检测和分析。用此套式PCR既能在PEDV临床检测中快速鉴定是否为变异毒株又能在指导合 理预防治疗等方面的提高参考依据。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测方法，包括以下步骤： ⑴合成目的片段:根据变异毒株的碱基插入原理，通过GenBank中PEDV的S基因序 列，利用DNA Star软件进行同源性分析后，完全自主设计TGEV荧光定量PCR检测方法的引 物； 应用Primer Premier5.0软件设计和筛选出两对引物， 外引物上游PEDV/F-1:5 ' -AACACTTAGCCTACCACA-3 ' ； 外引物下游PEDV/F-2:5 ' -GTGGAATCATTGGACAA-3 ' ； 内引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT‑PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)合成目的片段：根据变异毒株的碱基插入原理，通过GenBank中PEDV的S基因序列，利用DNA Star软件进行同源性分析后，完全自主设计TGEV荧光定量PCR检测方法的引物；应用Primer Premier5.0软件设计和筛选出两对引物，外引物上游PEDV/F‑1的序列如SEQ ID NO：1所示；外引物下游PEDV/F‑2的序列如SEQ ID NO：2所示；内引物上游PEDV/R‑1的序列如SEQ ID NO：3所示；内引物下游PEDV/R‑2的序列如SEQ ID NO：4所示；(2)套式RT‑PCR扩增反应：将PEDV毒株用Trizol法提取总RNA后进行反转录反应：2μL的RNA、1μL的PEDV/F‑2下游引物和3μL的ddH2O混匀，70℃反应10min，然后冰上急冷两分钟；此反应混合溶液再加入2μL 5×MLV buffer，0.5μL dNTP Mixture，0.25μL RNase Inhibitor，0.25μL M‑MLV以及1μL ddH2O；经42℃保温1h后，70℃保温15min，冰上冷却反应终止得cDNA；取2μL cDNA作为模板进行第一次PCR扩增：反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，外引物上游PEDV/F‑1和外引物下游PEDV/F‑2各1μL，r‑Taq酶0.5μL，ddH2O 16μL并混合均匀；按照下列条件进行扩增：94℃预变性5min；95℃变性30s，49℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min终止反应；(3)第二次套式RT‑PCR扩增反应：取2μL第一次PCR产物作为模板，进行第二次PCR扩增，配置25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，内引物上游PEDV/R‑1和内引物下游PEDV/R‑2各1μL，r‑Taq酶0.5μL，ddH2O16μL混合均匀；按照下列条件进行扩增：94℃预变性5min；95℃变性30s，51℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min终止反应；实现区分PEDV变异株和经典株的套式RT‑PCR检测。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贺东生，焦臣鹏，王飞，陈小芬，苏丹萍，罗华林，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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