一种鸭肝炎病毒琼扩抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种鸭肝炎病毒琼扩抗原及其制备方法与应用，所述琼扩抗原是将鸭肝炎病毒接种大量麻鸭胚进行培养增殖，收集胚尿囊液，通过低温超速离心进行病毒的浓缩，并通过蔗糖梯度离心及超速离心进行病毒纯化获得的鸭肝炎病毒琼扩抗原；通过条件优化，确定了最佳抗原和抗体反应浓度，通过特异性试验、重复性试验和灵敏性试验证实该方法简单可行，本发明专利技术利用所述琼扩抗原建立的鸭肝炎病毒抗体检测方法具有特异性强、稳定性好、敏感性高等特点，为鸭肝炎病毒抗体提供了简单、特异、灵敏、成本低廉和实用的检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及兽医诊断
，尤其是一种鸭肝炎病毒琼扩抗原及其制备方法与 应用。
技术介绍
鸭病毒性肝炎（Duck virus hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV)引起维鸭的一种传播迅速和高度致死性传染病，W肝脏呈现出血性炎症为特征 的急性烈性传染病。主要特征为肝脏肿大，有出血斑点和神经症状。在新疫区，本病的死亡 率很高，可达90 % W上。1945年在美国首次发现本病，并命名为I型鸭病毒性肝炎。 目前，对鸭病毒性肝炎的预防和控制主要W灭活疫苗、鸡胚弱毒疫苗、高免血清和 高免蛋黄抗体为主，而免疫效果的监测主要是通过中和试验测定中和抗体效价来进行。中 和试验操作繁琐、周期长、且对试验条件和技术的要求较高，一般基层兽医诊断站无法进行 检测。 针对养殖场及基层兽医检疫部口技术欠缺及设备简单的现状，W及鸭病毒性肝炎 血清抗体和蛋黄抗体等产品效价检测及免疫效果评价的需要，十分必要且紧迫需要创建一 种简单实用有效的鸭病毒性肝炎抗体检测方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种鸭肝炎病毒琼扩抗原。 本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述鸭肝炎病毒琼扩抗原的制备方法。 本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述鸭肝炎病毒琼扩抗原的应用。[000引为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是： -种鸭肝炎病毒琼扩抗原，是由下述方法得到的： (1)病毒繁殖:将第5代I型和第8代虹型鸭肝炎病毒接种10日龄非免疫麻鸭胚，收 获72小时至96小时内死亡鸭胚尿囊液，放于4°C保存； (2)病毒灭活:将收集的尿囊液经终浓度2%〇甲醒混合混匀，于37°C摇床内灭活24 小时； (3)病毒浓缩:将灭活好的尿囊液于4°C、800化/min离屯、45min，取上清，再于4°C、 4500化/min离屯、化，弃上清后沉淀用灭菌生理盐水重悬，得到病毒浓缩液，储存于-70°C; (4)病毒纯化:制备10%、20%、30%、40%和50%5个梯度的薦糖平衡液，化0%薦 糖液上加上病毒浓缩液，于4°C、40000r/min水平离屯、化后，收集病毒带，于4°C、45000r/min 离屯、化后，弃上清后沉淀用灭菌生理盐水重悬，用RT-PCR的方法检测各带的病毒含量，W 40 %带病毒含量最大，作为为琼扩抗原，储存于-70°C，即得。优选的，上述鸭肝炎病毒琼扩抗原，所述步骤（1)中将第5代I型和第8代虹型鸭肝 炎病毒接种10日龄非免疫麻鸭胚，0.1ml/枚，于38°C解化箱解育，弃去24小时内接种死亡的 鸭胚，收集72小时至96小时内死亡鸭胚，4°C静置6-8小时，收集尿囊液，放于4°C保存。 优选的，上述鸭肝炎病毒琼扩抗原，所述步骤(4)中使用20mL超速离屯、管，超速离 屯、管中每个梯度的薦糖平衡液3ml，在10%薦糖液上加病毒浓缩液3ml。 上述鸭肝炎病毒琼扩抗原的制备方法，具体步骤如下： (1)病毒繁殖:将第5代I型和第8代虹型鸭肝炎病毒接种10日龄非免疫麻鸭胚，收 获72小时至96小时内死亡鸭胚尿囊液，放于4°C保存； (2)病毒灭活:将收集的尿囊液经终浓度2%〇甲醒混合混匀，于37°C摇床内灭活24 小时； (3)病毒浓缩:将灭活好的尿囊液于4°C、800化/min离屯、45min，取上清，再于4°C、 4500化/min离屯、化，弃上清后沉淀用灭菌生理盐水重悬，得到病毒浓缩液，储存于-70°C; (4)病毒纯化:制备10%、20%、30%、40%和50%5个梯度的薦糖平衡液，在10%薦 糖液上加上病毒浓缩液，于4°C、40000r/min水平离屯、化后，收集病毒带，于4°C、45000r/min 离屯、化后，弃上清后沉淀用灭菌生理盐水重悬，用RT-PCR的方法检测各带的病毒含量，W 40 %带病毒含量最大，作为为琼扩抗原，储存于-70°C，即得。 优选的，上述鸭肝炎病毒琼扩抗原的制备方法，所述步骤（1)中将第5代I型和第8 代虹型鸭肝炎病毒接种10日龄非免疫麻鸭胚，0.1ml/枚，于38°C解化箱解育，弃去24小时内 接种死亡的鸭胚，收集72小时至96小时内死亡鸭胚，4°C静置6-8小时，收集尿囊液，放于4°C 保存。 优选的，上述鸭肝炎病毒琼扩抗原的制备方法，所述步骤(4)中使用20mL超速离屯、 管，超速离屯、管中每个梯度的薦糖平衡液3ml，在10%薦糖液上加病毒浓缩液3ml。 上述鸭肝炎病毒琼扩抗原在鸭肝炎病毒抗体检测中的应用。 优选的，上述鸭肝炎病毒琼扩抗原的应用，所述鸭肝炎病毒抗体检测方法为鸭肝 炎病毒抗体琼脂扩散试验检测方法。 优选的，上述鸭肝炎病毒琼扩抗原的应用，具体检测方法如下： (1)样品检测:取标准的打孔器在琼脂板上打梅花孔，每组7孔，共7组；中央孔加入 稀释度为1:8的本专利技术所述鸭肝炎病毒琼扩抗原，周围孔加检测样品，并将检测样品进行1: 4、1: 8、1:32、1:64、1:128倍比稀释，一组加稀释度为1:64的阳性血清作为阳性对照，一组加 阴性血清作为阴性对照； (2)结果判定:判定标准为：出现沉淀线且沉淀线成环状，与阳性对照相吻合，判定 为阳性;不出现沉淀线或沉淀线无规则者，判定为阴性。 优选的，上述鸭肝炎病毒琼扩抗原的应用，所述步骤(1)中琼脂板是由下述方法制 备得到的： (1)制板:取琼脂糖0.5g，NaCl 8.5g，加入蒸馈水中，在水浴中充分煮沸溶化，待琼 脂冷却至55°C左右时，倒入直径90mm的平皿，每个加20ml左右，待凝固后，用封口膜封住W 防变干，放入4°C冰箱保存备用； (2)打孔:取标准的打孔器打梅花型孔，中屯、孔与周围孔距3mm，将孔中的琼脂用针 头轻轻挑出即可； (3)封底:在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许烙化W封底，W免加样后液 体从孔底渗漏。 优选的，上述鸭肝炎病毒琼扩抗原的应用，所述步骤(1)中阳性血清的制备方法如 下:将灭活的第6代I型和第9代虹型鸭肝炎病毒液与弗氏完全佐剂按1:1比例进行乳化，免 疫3月龄W上健康的SPF鸡，间隔15d后再次免疫，Ξ免后15d采集血清，制备成阳性血清。 优选的，上述鸭肝炎病毒琼扩抗原的应用，所述步骤(1)中阴性血清的制备方法如 下:采集3月龄W上健康的SPF鸡血清作为阴性血清。 本专利技术的有益效果是： 上述鸭肝炎病毒琼扩抗原，选用当前流行的鸭肝炎病毒毒株I型和虹型，通过鸭胚 繁殖、超速离屯、浓缩，薦糖梯度离屯、进行纯化，制备的琼扩标准抗原为纯化高浓缩抗原，该 抗原特异性好、稳定性高、敏感性好、产量高；由该抗原进行鸭肝炎病毒抗体琼脂扩散试验 检测，可检测当前流行的I型和m型鸭病毒性肝炎血清和蛋黄抗体，该方法简单、成本低廉、 实用、有效，可W用于基层兽医站使用，降低了检测成本，缩短了检测时间，还可用于鸭肝炎 病毒蛋黄抗体产品的监测，具有较好的应用效果。【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术所述技术方案作进一步的说明。 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;下述实施例中所用的试 验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 实施例1鸭肝炎病毒琼扩抗原的制备 (1)病毒的获得I型和虹型鸭肝炎病毒，为本公司实验室从现地发病本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸭肝炎病毒琼扩抗原，其特征在于：是由下述方法得到的：(1)病毒繁殖：将第5代Ⅰ型和第8代Ⅲ型鸭肝炎病毒接种10日龄非免疫麻鸭胚，收获72小时至96小时内死亡鸭胚尿囊液，放于4℃保存；(2)病毒灭活：将收集的尿囊液经终浓度2‰甲醛混合混匀，于37℃摇床内灭活24小时；(3)病毒浓缩：将灭活好的尿囊液于4℃、8000r/min离心45min，取上清，再于4℃、45000r/min离心2h，弃上清后沉淀用灭菌生理盐水重悬，得到病毒浓缩液，储存于‑70℃；(4)病毒纯化：制备10％、20％、30％、40％和50％5个梯度的蔗糖平衡液，在10％蔗糖液上加上病毒浓缩液，于4℃、40000r/min水平离心3h后，收集病毒带，于4℃、45000r/min离心2h后，弃上清后沉淀用灭菌生理盐水重悬，用RT‑PCR的方法检测各带的病毒含量，以40％带病毒含量最大，作为为琼扩抗原，储存于‑70℃，即得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李丽琴，王建，程雪娇，朱士江，宋秀梅，王宇鹏，葛兆宁，王勇，焦晓军，余贵菊，甄盼盼，王猛，杨雪，于小婷，张立会，崔志刚，姜淋洁，
申请(专利权)人：天津市中升挑战生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12