酵母生产乙型肝炎表面抗原制造技术

揭示了包括调节区和编码乙型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）的结构编码的新ＤＮＡ建造．所用调节区对甲醇，非分解代谢产物抑制性碳源以及分解代谢产物抑制性碳源并后接缺乏碳源有反应．该新建造被掺入到各种线形和环状质粒中．这样的质粒用于转化适宜的宿主并最终用于高水平地生产和分离出乙型肝炎表面抗原．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用重组DNA技术生产乙型肝炎表面抗原。一方面，本专利技术涉及用酵母生产乙型肝炎表面抗原，另一方面，本专利技术涉及编码乙型肝炎表面抗原的新DNA构建，在又一方面，本专利技术还涉及用上述DNA构建转化的新生物。随着重组DNA技术在近来的发展，用微生物控制生产各种有用的多肽类已成为可能。许多真核多肽，例如人生长激素，白细胞干扰素，人胰岛素和人胰岛素原早已可用微生物生产了。继续使用现有的技术已被期望在将来能用微生物生产其他有用的肽类产物。这种有用的肽类产物之一就是乙型肝炎表面抗原。乙型肝炎(血清肝炎)病毒在人类中传播，并且证明它是慢性致虚弱疾病，该病逐渐导致严重的肝损伤，早期癌，而最后至死亡。在大多数情况下，可以期望从乙型肝炎病中完全恢复。但是，在人类中的一大部分，特别是在许多非洲和亚洲国家的人群中，很多人都是慢性携带者，具有传播传染病的潜在危险。有效地预防乙型肝炎，要施用乙型肝炎病毒疫苗，而疫苗通常是高度纯化的乙型肝炎表面抗原。这类乙型肝炎病毒疫苗对防止病毒的传染是有效的。特别危险的是需要输血或透析治疗的人们。从事这些工作的医务人员等待。此外，这类疫苗对防止产生新的带病者也是有效的，而且它还可以进而从地球上彻底消灭乙型肝炎病毒。乙型肝炎病毒还不能在细胞培养中传播，因而只能从人类或高级灵长类中获得。因此，还没有可以获得和保持充足的乙型肝炎病毒用以生产免疫乙型肝炎病毒的抗原。乙型肝炎病毒的疫苗通常是从乙型肝炎病毒携带者的血浆中分离或提纯乙型肝炎表面抗原而制备。由于在被提纯的血浆中只有很少量的所需抗原，所以就要求这种提纯方法是非常高效的。因此，迄今为止，以工业规模生产所需的乙型肝炎病毒疫苗是很困难的。本专利技术的目的之一是乙型肝炎表面抗原的高产方法。本专利技术的又一目的是制备能以高水平表达乙型肝炎表面抗原的新DNA构建。本专利技术的这些目的及其他目的在本专利技术的说明书和权项中将会清楚地表明。根据本专利技术，已经发现了用培养酵母细胞来高水平的生产乙型肝炎表面抗原的方法，酵母细胞用包括乙型肝炎表面抗原编码序列的DNA构建所转化，该序列受与甲醇，非分解代谢产物抑制性碳源和碳源缺乏起反应的调节区控制。图1是毕赤(Pichia)二羟丙酮合成酶基因(DAS)调节区的限制图谱。图2是初级毕赤醇氧化酶(AOX1)调节区的限制性图谱。图3是毕赤p40基因调节区的限制图谱。图4是质粒pAOP2的限制性图谱。图5是质粒pBSAG5和pBSAG5Ⅰ的构建图。图6是质粒pHBS-5的限制性图谱。图7是质粒pAOT-1的限制性图谱。图8是质粒pYJ33的限制性图谱。图9表示由质粒pSAOH5和pTHBS3建造质粒pYM39。图10表示由质粒pYM39和pPG3.2建造质粒pYMⅠ6。图11表示由质粒pYMⅠ6和pBSAG5Ⅰ建造质粒pBSAGⅠ5Ⅰ。图12表示将质粒pBSAGI5Ⅰ的一部分插入到毕赤染色体的初级醇氧化酶(AOX1)位置。图13是质粒pTHBS3的建造过程。以下的缩写是用在附图中代表所用的限制性酶。缩写 限制性酶As AsuⅡB BamHⅠB2BglⅡBc BclⅠC ClaⅠH2HincⅡH3HindⅢK KpnⅡNd1NdeⅠNr NruⅠPs PstⅠPv1PvuⅠPv2PvuⅠⅡR1EcoRⅠR5EcoRVS SalⅠSp SphⅠSs SstⅠSt StuⅠXb XbaⅠXh XhoⅠ在附图中，对用于操作DNA片段但在连接时被去掉的限制性位点，用将缩写符号包围在括号中的形式来指明去掉的位点。本专利技术提供了一种新的DNA片段，该片段包括一个调节区和一个多肽编码区，其中的多肽编码区编码乙型肝炎表面抗原或其一部分，而调节区一旦处于多肽编码基因的5′末端时，它就能控制信使RNA的转录。调节区，乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)基因，以及转录终止片段的组合，在此后被作为一种表达盒或表达单位。本专利技术中所用的调节区是对至少一种以下条件有反应的调节区，这些条件是培养基中存在着甲醇，而且含有表达盒的生物与培养基相接触，培养基中存在着非分解代谢产物的抑制性碳源而不是甲醇，含有表达盒的生物与该培养基相接触。培养基中缺乏碳怨，含有表达盒的宿主生物在经分解代谢产物抑制性碳源和能量的条件下生长之后，再与缺乏碳源的培养基相接触。根据本专利技术，还提供了新的含有上述表达盒的线形或环形的质粒。根据本专利技术，还提供了用上述线形或环形质粒转化的酵母菌株的基本纯净的培养物。根据本专利技术的另一实施方案，还描述了制备乙型肝炎表面抗原的方法，该方法包括，将用上述质粒转化了的酵母菌株在能表达所需蛋白产物的条件下进行培养。本专利技术实践中所用的调节区的特征在于与以下培养基的反应能力，这些培养基含有(1)甲醇，(2)非分解代谢产物抑制碳源，例如甘油，半乳糖，乙酸盐等，(3)分解代谢产物抑制碳源，如葡萄糖，乙醇，果糖等，然后接碳源缺乏。满足上述条件的示范性调节区由图1，2，3中的限制性图谱描绘出。图1中所给出的调节区是由巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)二羟丙酮合成酶(DAS)基因中衍生出来的。图2中阁出的调节区是从巴斯德毕赤酵母初级醇氧化酶(AOX1)基因中衍生出来的(Pichia有两个醇氧化酶基因，在此称作AOX1和AOX2)。图3中给出的调节区是从巴斯德毕赤酵母的p40基因衍生出来的。本专业领域的技术人员会知道，具有上述性质的其它调节区可以从甲基营养酵母如巴斯德毕赤酵母中分离出来。这些具有与上述调节区相似性质的调节区均属于本专利技术的范围之内。乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)基因已经被分离出(Valenzuela etal.Nature280，815)，而且用适宜的限制性内切酶处理载体就可获得，这些载体举例有pHBS-5(见图6和Valenzuela etal，，Nature298，347)，pHBV-T-1A(Genetech，EPA 73657)，pHBS-56(ATCC accession No40047;见EPT 12055)等。乙型肝炎表面抗原基因用Bal31核酸外切酶处理，从该基因的5′末端去除病毒性非编码序列而被修饰。HBs Ag基因的3′末端用核酸内切酶酶解并加入连接子去除病毒性非编码序列而得到修饰。乙型肝炎表面抗原基因经进一步修饰，以掺入易于操作DNA片段的限制性位点，所获的DNA片段是EcoRⅠ-StuⅠ插入体，并具有以下的核苷序列5′-GAATTCATGG AGAACATCAC ATCAGGATTC CTAGGACCCCTGCTCGTGTT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAATCCTCACAATA CCGCAGAGTC TAGACTCGTG GTGGACTTCTCTCAATTTTC TAGGGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAAATTCGCAGTC CCCAACCTCC AATCACTCAC CAACCTCCTGTCCTCCAATT TGTCCTGGTT ATCGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ片段，该片段包括：（ａ）一种调节区，该调节区当位于多肽编码区的５＇末端时能控制信息ＲＮＡ的转录，其中所说的调节区对以下各条件中的至少一种有反应：（１）在培养基中存在有甲醇，含有所述ＤＮＡ片段的宿主生物与其相接触，（２） 培养基中存在有非分解代谢产物抑制性碳源而不是甲醇，含有所述ＤＮＡ片段的宿主生物与其相接触，（３）培养基中缺乏碳源，含有所述ＤＮＡ片段的宿主生物在有分解代谢产物抑制性碳源和能源的条件下生长之后再与该培养基接触；（ｂ）一种多肽编码区，该 编码区编码乙型肝炎表面抗原或其蛋白。

【技术特征摘要】
US 1985-11-26 801,7131.一种DNA片段，该片段包括(a)一种调节区，该调节区当位于多肽编码区的5′末端时能控制信息RNA的转录，其中所说的调节区对以下各条件中的至少一种有反应(1)在培养基中存在有甲醇，含有所述DNA片段的宿主生物与其相接触，(2)培养基中存在有非分解代谢产物抑制性碳源而不是甲醇，含有所述DNA片段的宿主生物与其相接触，(3)培养基中缺乏碳源，含有所述DNA片段的宿主生物在有分解代谢产物抑制性碳源和能源的条件下生长之后再与该培养基接触；(b)一种多肽编码区，该编码区编码乙型肝炎表面抗原或其蛋白。2.根据权项1所说的DNA片段，其中所说的调节区的特征如图2的限制性图谱所示。3.根据权项1所说的DNA片段，其进一步包括位于多肽编码区下游方的DNA3′序列;其中所说的DNA3′序列能控制由所述多肽编码区编码之信息RNA的多腺苷化和其转录的终止。4.根据权项1所说的DNA片段，其进一步包括一种或更多种另外的DNA序列，这些DNA序列来自下组细菌质粒DNA，噬菌体DNA，酵母质粒DNA，和酵母染色体DNA。5.根据权项4所说的DNA片段，其中所说的酵母染色体DNA包括自动复制DNA序列和识别基团。6.根据权项3所说的DNA片段，其中所说的DNA片段进一步包括一个或更多个另外的DNA序列，这些DNA序列来自下组细菌质粒DNA，噬菌体DNA，酵母质粒DNA，和酵母染色体DNA。7.根据权项6所述的DNA片段，其中所述的酵母染色体DNA包括自动复制DNA序列和识别基团。8.根据权项1所述的DNA片段，其进一步包括一系列排列的DNA，这些DNA包括第一可插入DNA片段，选择识别基因，第二可插入DNA片段;其中所说的第一和第二可插入DNA片段各自长度至少为200个核苷酸并且具有与毕赤属基因组DNA的蛋白同源的核苷酸序列;其中所说的DNA片段和所说识别基因位于所述第一可插入DNA片段的3′末端与所述第二可插入DNA片段5′末端之间，其中所说第一和第二可插入DNA片段相互之间的定向与它们在毕赤基因组中的定向相同。9.根据权项1所述的DNA片段，其中所说的多肽编码区基本上有700个碱基对的EcoRⅠ-StuⅠ片段组成，该片段如下5′-GAATTCATGG AGAACATCAC ATCAGGATTC CTAGGACCCCTGCTCGTGTT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAATCCTCACAATA CCGCAGAGTC TAGACTCGTG GTGGACTTCTCTCAATTTTC TAGGGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAAATTCGCAGTC CCCAACCTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：米格弗里德里克斯少普，迈克尔米勒哈波尔德，詹姆斯迈克尔克里格，理查德格登布克霍茨，
申请(专利权)人：菲利普石油公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]