重组体杆状病毒载体中乙型肝炎病毒抗原的表达制造技术

本发明专利技术介绍在昆虫和昆虫培养细胞中，人体乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）抗原的表达。用重组体杆状病毒感染受纳昆虫和受纳细胞。在杆状病毒ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ基因启动子的控制下，重组体杆状病毒具有必需的插入杆状病毒基因组的人体ＨＢＶ基因，并代替病毒ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ蛋白的起始（５＋［＇］）编码顺序。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生产人体病毒性乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及其有关的Pre-S2蛋白质的方法。人体乙型肝炎病毒HBV，即hepadna病毒种群之一是引起遍及世界的慢性肝病和肝癌的常见病因。该病毒基因组包括小圆形的、部分是单链的脱氧核糖核酸(DNA)物种，在病毒颗粒中与病毒DNA聚合酶相连接。DNA聚合酶的功能使病毒DNA成为双股形式，以及在感染细胞内复制病毒DNA。HBV具有肝细胞向性。人们相信这种向性的分子基础存在于病毒颗粒的表面蛋白中，在开始感染的某个阶段，与存在于受纳细胞上的细胞结构(受体)反应。细胞和人体受感染开始可被由人体抗外源病毒蛋白中产生的抗体阻滞。人们通常从急性病开始感染，常常导致长期的慢性病，包括高浓度病毒抗原(某些以所谓22毫微米非感染形式颗粒或澳大利亚病毒抗原)和42毫微米感染病毒(“Dane颗粒”)在传染期的患者血液中循环的持续性病毒感染。还在其他体液中发现病毒和病毒抗原(精液、唾液、鼻咽分泌物、经血、腹水、胆汁、泪液、乳液、脑脊髓液等)，及随环境传播的病毒。人体“病原携带者”在急性感染期和慢性感染期，对疾病的流行病学都是重要的。脂膜小球结构形式的所谓22毫微米颗粒(15～22毫微米)是作为受纳细胞活性病毒感染的副产品产生的。它主要由包埋在脂膜中的病毒(主要为HBsAg及一些Pre-S2)表面蛋白(抗原)组成。还在患者血液中发现含这些抗原的其它病毒诱发结构是丝状或杆状结构(有22毫微米宽，但有几百毫微米长)。HBsAg是用病毒遗传信息表示蛋白组分的病毒编码糖蛋白(有多至3个碳水化合物侧链的蛋白)，以及用病毒所生长的细胞机器表示碳水化合物组分。像传染病毒那样，22毫微米脂类组分和其它颗粒是由病毒所生长的宿主细胞脂膜衍生的。这样，脂类和碳水化合物组分都可用细胞表示。HBsAg蛋白序列、其内在的抗原结构和碳水化合物侧链的附着位点，以及植入在脂类内的HBsAg蛋白部分都用病毒遗传序列表示。球形42毫微米传染的病毒颗粒包括DNA内部核心和结合DNA聚合酶，其包括由7毫微米脂类组成的外壳包围的核心抗原(HBcAg)和“e”抗原(HBeAg)、HBsAg和一些Pre-S2蛋白。Pre-S2是病毒和其它病毒诱发结构的微量组分，可代表对HBsAg不完全处理的蛋白质前体，因为它含有整个HBsAg序列及在HBsAg的氨基末端(“上游”)大约55个额外氨基酸。在由BN Fields编的“Virology”(Raven Press)NW.1392页图5中表示的包含大约3200碱基长HBV(Robinson，1985年)的限制性内切酶位点(Bam HI，Acc I，等)的位置。在部分双股病毒DNA的完全(长)链中DNA具有4个开译读码(ORF)，ORF包括可从互补信使核糖核酸(mRNA)序列转译成氨基酸(蛋白质)连接序列的DNA核苷酸序列。ORF-2包含表达处于同相和163个氨基酸“Pre-S”序列下游的大概25，000道尔顿HBsAg(约200个氨基酸)的序列。不能确定HBcAg和Pre-S2蛋白质是如何由ORF-2编码序列衍生而来，ORF-3编码用于相当于HBcAg(190～220个氨基酸)的主要核心蛋白。ORF-1(多半是病毒聚合酶)和ORF-4的基因产物是否相同还未肯定。人受HBV感染通常包括熟友(常经皮肤接触)血清和含个人之间物质的血清的传输(此处为血清性肝炎的又一名称)。该疾病特别流行于发展中国家，如中国、大洋洲、南太平洋、非洲、中东及南美洲和印度的某些地区，在东南亚的一些国家中这种患病率很高(5～20%)，然而这种病还发生在世界的其它地区，尤其在特殊的少数民族人群之中，即与慢性病毒携带者的密切接触、与急性乙型肝炎患者的性接触、受感染母亲的新生儿、性乱交者、共用注射针的违法吸毒者、接受血制品的血友病患者、血液渗析患者及与其接触者，以及医护人员(牙医师、护士、外科医师、临床化验室工作人员)。肝癌细胞和乙型肝炎病毒感染的结合被认为是由于从慢性抗原血症导致慢性肝炎、肝硬化，然后肝细胞瘤发展的起始病毒感染。诊断受乙型肝炎病毒的感染，通常从疾病患者的临床主诊开始，继之以检查妨碍患者代谢的生化试验(转氨酶、胆红素等)。在乙型肝炎病毒感染开始以后，产生对HBcAg、HBsAg和HBeAg的抗体，由此鉴定血液中的病毒抗原(包括病毒)(粪便等;1～6月;放射免疫测定〔RIA〕，酶连接的免疫吸附剂测定〔ELISA〕，免疫电泳法，血凝反应等)，或病毒特殊抗体的存在(例如用RIA、ELISA、免疫电泳法、血凝反应等鉴定早期免疫球蛋白M抗HBcAg〔2～8月〕;免疫球蛋白G抗HBeAg〔4～10个月〕和免疫球蛋白G抗HBcAg〔5～6月和终生〕，从而诊断乙型肝炎病毒的感染。虽然细节并未肯定，可相信受纳细胞中涉及到HBV的感染过程包括基因组从病毒衣壳组分中脱出，病毒DNA移位至细胞核，病毒DNA的合成使DNA基本上成圆形，在基因组中mRNA的转录和从病毒启动子完全RNA复制，RNA移位至细胞质，病毒蛋白物种从mRNA物种转译，以及从病毒RNA转录本的基因组DNA复制的蛋白首次接触抗原(逆转录作用)。最后，形成病毒核心结构，包括部分连接核心抗原(蛋白)基因组的双股DNA形式。转译以后，HBsAg(和Pre-S2)的处理和移位至细胞表面，在细胞表面发生核心结构的包膜。病毒从细胞表面释放使其它细胞受感染。从包含22毫微米颗粒和丝状形而缺乏病毒DNA但具有HBsAg的未成结构的感染细胞的释放，也发生在细胞表面。乙型肝炎病毒表面抗原和相关的Pre-S2蛋白在诊断疾病中，可用作鉴别患者体液中诱发病毒抗体的抗原，或者用于产生为了鉴别患者或其它物质中病毒抗原的参照抗体。HBsAg和Pre-S2蛋白也可用于预防由于接种的感染。从活的病毒取得HBsAg和Pre-S2蛋白质的现代方法存在着原料不足的不利因素，而任何生产的方法包括对感染的病毒的利用，由于存在着使生产工作者受感染的危险，以及活的病毒传进所需要的产品中的可能性，所以可能是危险的。现今采用的应用重组体DNA技术生产HBsAg和Pre-S2蛋白质的方法包括原核细胞的转化已经证明不是特别有效的。已经发现，应用以杆状病毒为基础的表达载体感染昆虫或昆虫细胞，可以很容易地生产出HBsAg和Pre-S2蛋白质。因此根据本专利技术的一个方面，提供了生产多肽的一种方法，至少包括HBsAg或Pre-S2蛋白质的一种抗原部分，这个方法包括在polyhedrin启动子的表达控制下，用包括具有用于所说的多肽编码的一个DNA片段的重组体杆状病毒表达载体来感染敏感的昆虫或昆虫细胞。本专利技术也包括这种重组体杆状病毒本身。这样，本专利技术提供包括人体乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和由生长在昆虫或昆虫培养细胞的重组体杆状病毒合成相关的Pre-S2蛋白的产物。该重组体杆状病毒可通过带有传染性杆状病毒DNA的昆虫培养细胞与杆状病毒转移载体质粒的共转染产生，该质粒含有构建代表乙型肝炎病毒抗原和代替杆状病毒多面体(polyhedrin)基因的起始端(5′)编码序列的基因，但是要在残余多面体(polyhedrin)启动子的控制下。表达肝炎抗原的polyhedrin阴性病毒，存在于共转染的子代中是传本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产至少含有一种ＨＢｓＡｇ或Ｐｒｅ－Ｓ２蛋白质的抗原部分的多肽的方法，该方法包括用一种含有重组体杆状病毒的表达载体，在一种ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ启动子的表达控制下，感染敏感的昆虫或昆虫细胞，所说的重组体杆状病毒具有用于上述多肽编码的一种ＤＮＡ片段。

【技术特征摘要】
GB 1986-9-8 8621578;GB 1986-9-23 86228831.一种生产至少含有一种HBsAg或Pre-S2蛋白质的抗原部分的多肽的方法，该方法包括用一种含有重组体杆状病毒的表达载体，在一种polyhedrin启动子的表达控制下，感染敏感的昆虫或昆虫细胞，所说的重组体杆状病毒具有用于上述多肽编码的一种DNA片段。2.根据权利要求1的方法，其中重组体杆状病毒具有Polyhedrin-非表现型(negative phenotype)。3.根据权利要求1或2的方法，其中重组体杆状病毒是从Autographa californica核多角体病毒衍生出的重组体杆状病毒。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴维HL毕晓普，康赐永，
申请(专利权)人：戴维HL毕晓普，康赐永，
类型：发明
国别省市：GB[英国]