本发明专利技术涉及一种检测家蚕二分浓核病毒的LAMP引物及其试剂盒，属于病毒疫病诊断技术领域；所述引物是根据GenBank公布的家蚕BmBDV病毒VP序列的保守区域设计；提取BmBDV病毒DNA后，采用包含所述引物的与反应液进行LAMP反应，在反应结束后利用核酸染料SYBR Green I颜色变化判定结果，结果显示在62℃反应30min后，BmBDV病毒DNA获得了高效特异性扩增，同常用检测技术相比，本发明专利技术具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，而且可用于生产一线的技术人员和蚕农现场使用，有利于该病毒病的诊断与预防。
【技术实现步骤摘要】
一种检测家蚕二分浓核病毒的LAMP引物及其试剂盒
本专利技术涉及一种检测家蚕二分浓核病毒的LAMP引物及其试剂盒，具体涉及一组环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）技术检测家蚕BmBDV病毒引物及其试剂盒，属于病毒疫病诊断
技术介绍
家蚕二分浓核病毒（BombyxmoriBidensovirus，BmBDV）属于细小病毒科浓核病毒亚科。BmBDV主要感染家蚕，病毒感染的家蚕幼虫的症状包括厌食、腹泻及软化，体型消瘦，出现迟眠、胸部半透明的空头等现象最终停止进食。该病毒具有高致死率，感染持续时间较长，引起慢性蚕病，是我国夏秋季节蚕茧等经济产品减产的重要原因之一。研究表明，BmBDV为无囊膜的球状病毒粒子，直径约20-24nm，包含2个线性单链DNA分子，大小分别约6.5kb（VD1）和6kb（VD2），其序列已测定并在GeneBank上登录（登录号DQ017268和DQ017269）。目前该病毒的检测方法有电镜法、PCR检测法等，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是灵敏度不够，无法检测到潜伏感毒样品；二是容易产生假阳性，对模板质量要求高；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于养殖户和一线生产技术人员来操作。LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，反应时先由外部引物将内部引物扩增所需要的模板扩增出来，然后由内部引物对靶基因片段进行引导合成。由于内部引物所扩增出的片段含有与该引物5’端DNA片段的反相互补序列，因此这些反相互补序列之间形成茎-环结构，同时，另外一条内部引物与也可形成茎-环结构，片段的两端形成哑铃状结构，如此循环往复的过程最后形成花椰菜形状的茎-环结构，可在15min-60min之内实现109-1010倍的扩增。该技术简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、染料显色法和荧光染料观察等方法。琼脂糖凝胶电泳和荧光染料观察需要专门的设备，浊度观察在含量较低时也较难观察，核酸染料直接显色法比较适合现场快速检测需求。目前常用的核酸染料有钙黄绿素（Calcein）、SYBRGreen、羟基萘酚蓝（HNB）、EvaGreen等。利用核酸染颜色的变化来判定检测结果，这种方法具有安全、快捷、高效的特点，适合应用推广。目前，该方法在家蚕BmBDV的检测中未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一组检测BmBDV病毒的LAMP的引物，并提供一种用于检测家蚕的BmBDV病毒的LAMP检测试剂盒。该试剂盒特异性强，敏感率高，而且操作简便快捷，克服现有检测方法不能在生产中直接应用的问题，适合家蚕BmBDV的筛查。本专利技术所述的引物是根据GenBank公布的BmBDVVP序列（Accessionnumber:YP_007714630.1）设计修改后获得，利用不同引物的反应结果进行筛选，由其中选出三对引物：引物BmBDV-F3（SEQIDNO:1）：TCTGACGTTGGTGGAAGT引物BmBDV-B3（SEQIDNO:2）：AACTTGCTTTCCACTCGA引物BmBDV-FIP（SEQIDNO:3）：TGAGGCGTCCATAGGACCTTTTTTGGAAGTGGAAAACGCAGT引物BmBDV-BIP（SEQIDNO:4）：GAGGATCTGGAGGTGGTGGTTTTTTTGGCTTGTAAATAGGTTGG引物BmBDV-LF（SEQIDNO:5）：ACCGCCCCCAGACACATT引物BmBDV-LB（SEQIDNO:6）：GGAGGTGCTTCAGCAGAGG本专利技术还提供一种家蚕BmBDV病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含家蚕BmBDV病毒LAMP预反应液，所述预反应液包含上述三对检测家蚕BmBDV的LAMP特异性引物。具体的，所述预反应液包括：1.5～2.0mMBmBDV-FIP和BmBDV-BIP，0.2～0.4mMBmBDV-F3和BmBDV-B3，0.2～0.5mMBmBDV-LF和BmBDV-LB，20～40mMTris-HCl(pH8.0～9.0)，10～15mM氯化钾，15～20mM硫酸铵，8～10mM硫酸镁，0.1～0.2%TritonX-100，1.2～1.4mMdNTP，6-8UBstDNA聚合酶大片段（NewEnglandBiolabs），0.6～0.8M甜菜碱；在反应管盖中用低熔点固体石蜡封入1μLSYBRGreenI。本专利技术还提供一种家蚕BmBDV病毒LAMP检测方法，包括以下检测步骤：S1.家蚕样品中BmBDV基因的提取：（1）取20～30mg家蚕整蚕或蚕沙，或20µL家蚕血淋巴，加入500μL裂解液RA后用研磨棒研磨匀浆，然后加入20µL蛋白酶K以及20µLRNaseA（20mg/mL）混匀，56℃水浴30min，至组织完全裂解；（2）将混合物转入带有硅胶膜的吸附柱中，12000rpm离心1min，弃掉废液；（3）加入600μL去蛋白液RC，室温静置1min，12000rpm离心30～60s，弃掉废液；（4）加入600μL漂洗液RD，12000rpm离心30s,弃掉废液；重复该步骤一次。（5）在吸附柱中加入50μLTE,室温放置1min，12000rpm离心1min。可重复该步骤一次，增加DNA洗脱量。S2.家蚕BmBDV病毒LAMP扩增：（1）根据待检样品数，配制所需的预反应液（含阳性对照、阴性对照），在预反应液中加入2～5μLDNA模板，再加入适量的去离子水，使反应体系总体积为25μL。（2）标记清楚后，将检测反应管置于61～65℃，反应45-60min，85℃灭活并溶解低熔点固体石蜡使得染料溶于反应液；其中最适反应温度为62℃，最适反应时间为30min。（3）肉眼观察反应体系的颜色变化，同时产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳分析。与现有检测技术比较，本专利技术所提供的家蚕BmBDV病毒LAMP检测方法具有以下优点：（1）本专利技术所采用引物组是根据BmBDV结构蛋白(VP)基因的六个不同区域设计的，又有环形引物(BmBDV-LF和BmBDV-LB),反应速度（常规PCR通常需要2个小时左右，而用这个方法只需要30分钟），反应速度高于常规PCR；（2）本专利技术的快速诊断试剂盒检测灵敏度高，是常规PCR的1000倍；（见图4，图5）（3）本专利技术的快速诊断试剂盒检测时间短，可以在30min内获得检测结果，比常规PCR节约3～4小时；（4）本专利技术的快速诊断试剂盒对仪器设备要求低，可通过肉眼直接观察；（5）本专利技术中的DNA提取方法简单快捷，而且不用到氯仿、巯基乙醇等有害物质；（6）本专利技术的检测试剂盒操作步骤简单，结果直观易判定，处于生产一线的技术员和蚕农都可以按步骤指导进行操作；（7）本专利技术的检测试剂盒对人和环境安全。附图说明图1为扩增温度对LAMP反应的影响结果；M：DL2000DNAMarker(TaKaRa公司)；泳道1：60℃恒温条件下扩增结果；泳道2：61℃恒温条件下扩增结果；泳道3:62℃恒温条件下扩增结果；泳道4：63℃恒温条件下扩增结本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组检测BmBDV病毒的LAMP的引物，所述引物包括3对引物，引物BmBDV‑F3：TCTGACGTTGGTGGAAGT，引物BmBDV‑B3：AACTTGCTTTCCACTCGA；引物BmBDV‑FIP：TGAGGCGTCCATAGGACCTTTTTTGGAAGTGGAAAACGCAGT，引物BmBDV‑BIP：GAGGATCTGGAGGTGGTGGTTTTTTTGGCTTGTAAATAGGTTGG；引物BmBDV‑LF：ACCGCCCCCAGACACATT，引物BmBDV‑LB：GGAGGTGCTTCAGCAGAGG。
【技术特征摘要】
1.一组检测BmBDV病毒的LAMP的引物，所述引物包括3对引物，引物BmBDV-F3：TCTGACGTTGGTGGAAGT，引物BmBDV-B3：AACTTGCTTTCCACTCGA；引物BmBDV-FIP：TGAGGCGTCCATAGGACCTTTTTTGGAAGTGGAAAACGCAGT，引物BmBDV-BIP：GAGGATCTGGAGGTGGTGGTTTTTTTGGCTTGTAAATAGGTTGG；引物BmBDV-LF：ACCGCCCCCAGACACATT，引物BmBDV-LB：GGAGGTGCTTCAGCAGAGG。2.一种家蚕BmBDV病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含家蚕BmBDV病毒LAMP预反应液，所述预反应液包含权利要求1所述的检测家蚕BmBDV的LAMP引物。3.根据权利要求2所述的一种家蚕BmBDV病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述预反应液包括：1.5～2.0mMBmBDV-FIP和BmBDV-BIP，0.2～0.4mMBmBDV-F3和BmBDV-B3，0.2～0.5mMBmBDV-LF和BmBDV-LB，20～40mMTris-HCl(pH8.0～9...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕鹏，陈克平，潘晔，林锋，姚勤，杨艳华，朱菲菲，马上上，陈亮，聂志超，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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