本发明专利技术公开一种检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用。该试剂盒包含核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～6所示的引物组和核酸检测试纸条。该试剂盒的使用方法如下：首先配制RT-LAMP反应体系，包含AMV逆转录酶、1倍反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、dNTP混合物、甜菜碱、MgSO4、FIP引物、BIP引物、LoopF引物、LoopB引物、F3引物、B3引物以及待测样品RNA；恒温反应所得产物用核酸检测试纸条检测后直接进行判读：阳性结果为出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，易于大范围推广应用。
【技术实现步骤摘要】
检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用。
技术介绍
猪传染性胃肠炎(transmissiblegastroenteritisof swine, TGE)是由冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus, TGEV)引起猪的一种高度接触性肠道疾病。该病以呕吐、严重腹湾和失水为特征，各种年龄和品种的猪均易感，尤其是两周龄以内的仔猪感染后致死率可高达100%，虽然5周龄以上猪的死亡率很低，但这些猪通常成为僵猪，饲料报酬低。该病是导致世界各养猪国家仔猪早期死亡的重要疫病之一。临床资料显示早在1933年，美国依利诺斯州就关于TGEV的记载，但直到1945年Doyle和Hutchings才确定该病的病原为病毒，日本1956和英国1957年先后报道TGE的发生与流行，自此之后欧美亚等多个国家相继报道发生了 TGEV的传播流行，现已成为一种世界性病毒性传染疫病。我国从20世纪50年代起就有发生TGE流行的报道，1956年台湾省首次分离到TGEV，到目前为止我国大部分省市(自治区)都有该病的发生流行，近年来有流行加剧的趋势，尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性爆发流行，给养猪业造成极大危害。TGEV属于冠状病毒属,是一种多形性有囊膜的病毒。TGEV核酸为单股RNA,病毒粒子呈圆形或椭圆形，直径约为90~160nm，外膜上覆有花瓣状纤突，纤突长(约18~24nm)而稀疏，末端呈球状，直径IOnm左右。某些病毒粒子在以磷钨酸负染后，可见到一个电子透明中心或没有特征的核心，其内部具有一个`呈串珠样的丝状物。病毒粒子由3种主要结构蛋白构成，一种是磷蛋白(N，即核蛋白)，它包裹着基因组RNA;另一种是膜结合蛋白(M或El)，主要包埋在脂质囊膜中；第三种为大的糖蛋白(S或E2)，它形成病毒的突起。据推测，E2在决定宿主细胞亲嗜性方面起作用，还具有膜融合作用，使病毒核蛋白进入细胞浆，E2还携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，在提高获得免疫力中可能起关键作用。TGE病毒只有一个血清型，各毒株之间有密切的抗原关系，但也存在广泛的抗原异质性。TGE病毒与猪血凝性脑脊髓炎病毒和猪流行性腹泻病毒无抗原相关性，但与猪呼吸道冠状病毒有交叉保护。TGE病毒与狗冠状病毒(CCV)和猫冠状病毒(FIPV)之间都有抗原相关性。通过血清中和试验和间接免疫荧光法证明，TGE病毒与CCV、TGE病毒与FIPV之间存在双相交叉反应，只是同源病毒的中和滴度高于异源病毒。因此，这三种病毒在流行病学、诊断和免疫方面有一定的关系。由于猪传染性胃肠炎的临床症状与猪流行性腹泻病毒以及猪轮状病毒引起疾病的临场症状十分相似，因此不能从临床症状上对猪传染性胃肠炎进行确诊。因此在实验室建立猪传染性胃肠炎病毒的诊断是十分必要的。目前，有许多技术可用于PEDV的检测，如免疫荧光法、免疫组织化学技术、直接电镜、免疫电镜、酶联免疫吸附试验、阻断ELISA、链霉亲和素-生物素技术、原位杂交法、竞争阻断ELISA。然而这些检测方法不但费时，而且特异性和敏感性较低。环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是由日本学者Notomi于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，通过一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下进行革巴序列高效快速扩增。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人(Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplificationmethod for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus.ClinMicrobiol, 2004May ；42(5):1956-61)于 2004 年根据 LAMP 原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-Cov，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；MasakiImai 等人(Rapid diagnosis of H5Nlavian influenza virus infection by newlydeveloped influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermalamplification method.Virol Methods.2007May; 141 (2): 173-80.)于 2007 年建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。由于LAMP的扩增产物是白色焦磷酸镁沉淀，用肉眼难以观察，日本已研制出专门对LAMP产物进行实时监控的浊度仪。但是浊度仪的使用不但增加了费用，而且不方便携带；有学者利用往反应后的体系中加入SYBR Green I染料的方法来检测扩增产物，但是这样观察又必需开盖处理，LAMP扩增的高效性及高敏感性使得产物中含有大量目的片段，开盖添加染料极其容易污染环境。后来，有研究对LAMP方法作进一步改进，在原有LAMP反应试剂的基础上添加钙黄绿素和氯化锰后，可以衍生出另外一种更为简便的可视化LAMP，一步即可完成LAMP扩增及结果判定，LAMP产物无需开盖分析即可用肉眼观察结果。但这种方法因存在假阳性率过高、弱阳性结果的判别不够准确、且钙黄绿素与锰离子的浓度配比体系不稳定等缺点而使该方法的应用推广受到限制。
技术实现思路
本专利技术首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，该试剂盒具有高灵敏度、高特异性、可视化、操作方法简单等优点。`本专利技术的另一目的在于提供实现上述检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，包含如下引物组和核酸检测试纸条:所述的引物组的核苷酸序列如下所示:F3:5， -CAAGAGACACTACGCCTAAG-3，；B3:5， -AATGCTGGACACAGATGG-3，；FIP:5，-GGCTGAACTACTTCGAGTTCCAACACACCTGGAAGAGAAC-3，；BIP:5’ -GGTGACAGTGACCTTGTTGCACATTCGGCCAATTGTGG-3’LoopF:5’ -Biotin-TCTTGTCACATCACCTTTACCTG_3’ ；LoopB:5，-FITC-GGAGCAGTGCCAAGCATTAC-3，；所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条；所述的检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒优选包含上述引物组和全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置；所述的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为杭州优思达生物技术有限公司产品；该检测装置是通过将通用型本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测猪传染性胃肠炎病毒的RT?LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于包含如下引物组和核酸检测试纸条：所述的引物组的核苷酸序列如下所示：F3:5’?CAAGAGACACTACGCCTAAG?3’；B3:5’?AATGCTGGACACAGATGG?3’；FIP:5’?GGCTGAACTACTTCGAGTTCCAACACACCTGGAAGAGAAC?3’；BIP:5’?GGTGACAGTGACCTTGTTGCACATTCGGCCAATTGTGG?3’；LoopF:5’?Biotin?TCTTGTCACATCACCTTTACCTG?3’；LoopB:5’?FITC?GGAGCAGTGCCAAGCATTAC?3’。
【技术特征摘要】
1.一种检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于包含如下引物组和核酸检测试纸条: 所述的引物组的核苷酸序列如下所示: 2.根据权利要求1所述的检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于:所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。3.根据权利要求2所述的检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于:包含全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置和权利要求1所述的引物组；全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。4.根据权利要求1所述的检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于:还包含dNTP混合物溶液、MgSO4溶液、反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、甜菜碱溶液和AMV逆转录酶。5.根据权利要求4所述的检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于:包含浓度为5υ/μ L的AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液、浓度为8U/L的链置换DNA聚合酶、浓度为2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、浓度为lOmol/L的甜菜碱溶液、浓度为IOOmmoI/L的MgSO4溶液、浓度为10ymol/L的引物FIP、浓度为10ymol/L的引物BIP、浓度为ΙΟμπιοΙ/L的引物F3、浓度为ΙΟμπιοΙ/L的引物B3、浓度为ΙΟμπιοΙ/L的引物LoopF和浓度为10 μ mol/L的引物LoopB。6.权利要求1~5任一项所述的检测猪传染性胃肠炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于包含以下步骤: (1)配制RT-LAMP反应体...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈金顶，邓洁汝，勾红潮，裴晶晶，叶佐东，刘翠翠，郑仲华，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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