本发明专利技术涉及扩增和/或检测方法，其用于防止含有希望扩增的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的污染物，所述方法包括如下步骤：a)对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，以使得所述感兴趣的核酸的一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基；b)加入扩增引物，用以特异性扩增所述转变的感兴趣的核酸，每种引物由三种不同类型的碱基组成；c)在这些处理之后，在所述生物学样品中加入扩增所必需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶，以及预先合成的所述引物；d)将所述溶液和试剂置于使得转变的核酸被扩增和/或被检测的条件下。本发明专利技术还涉及应用所述方法的试剂盒，以及涉及所述方法或者所述试剂盒在特异性扩增和检测细菌、真细菌、真菌、泛真菌(pan-fungal)、病毒或者酵母靶中的应用。本发明专利技术优选用在诊断领域中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是申请日为2010年1月4日，申请号为201080004048.X，标题为“核酸的扩增和/或检测方法、试剂盒及所述方法的应用”的专利申请的分案申请。本专利技术涉及一种扩增方法，其用于防止含有希望扩增的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的污染物，在这种方法中，处理所述生物学样品以使得所述感兴趣的核酸的一种碱基转变为另一种碱基，以及导入特异于转变的核酸的引物和检测探针。本专利技术还涉及应用所述方法的试剂盒，以及所述方法或者试剂盒在特异性扩增和检测细菌、真细菌、真菌、泛真菌(pan-fungal)、病毒或者酵母靶中的应用。分子生物学的进步已经使其可以操作核酸。目前体外基因扩增方法在生物学诊断中成为必不可少的工具，例如使得已知DNA或者RNA序列可以被大量拷贝，在相对短的时间内以十亿的数量级倍增。这些技术的主要缺点是不希望的核酸被扩增，导致错误的结果，即甚至在不存在所寻找的靶的情况下出现阳性结果。这些被称作由于污染所致的假阳性。通过PCR(聚合酶链反应)、NASBA(基于核酸序列的扩增)、TMA(转录介导的扩增)或者扩增遗传学材料的任何其它技术扩增细菌靶是一种灵敏性技术，其要求使用没有所有痕量污染核酸的水溶液、酶、试剂等以及塑料容器。事实上，由于这些技术的灵敏性，这些污染核酸可以被扩增，并且可以产生假阳性，显著降低了诊断检验的可靠性。在细菌或者真菌扩增情况中这是真实存在的，甚至在泛细菌(也称作真细菌(eubacterial))和泛真菌扩增中更明显，其中使用的引物(和探针)能扩增(及检测)大多数细菌或者真菌靶。此外，在这种特殊的情况中，用于生产扩增试剂盒的大多数试剂衍生自天然来源(核苷酸、酶等)，因此外源核酸污染的潜在危险较高。因此，在用于评估生物学样品中细菌污染水平并通过扩增进行的检测中，由于使用的一些酶衍生自细菌克隆并提供可能被扩增的核酸，因此会系统地产生阳性结果，导致错误的诊断。这种污染也可以来自环境及来自去污不良的设备，例如：实验工作台、实验人员、设备以及移液装置，甚至是塑料容器。已经实施了针对限制这些污染的一些建议。这些建议包括例如涉及样品处理(特别是灭菌技术)或者实验设备(物理上分隔的工作带，使用排风罩，在外部和内部之间的压力梯度，以便流体总是使得以希望的方向排出等)的预防方法。正如已经提及的，不可忽略的污染源存在于实际用于扩增反应的原材料中，如酶、试剂、塑料容器中。因此，Corless C.E.等描述了Taq聚合酶的污染对于检测RNA 16S的实时PCR灵敏性的不利影响(J.Clin.Microbiol.；(2000)；May；38(5):1747-52)。纠正扩增所需的酶污染第一种方式是酶促去污染方法。由Ashkenas S.et al.(Biotechniques；2005；Jul.；39(1):69-73)描述的酶促方法包括对含有扩增必需的所有元素的溶液进行去污染。这种方法包括在RT-PCR范围内使用限制酶混合物。这些酶使含有待扩增的靶RNA的扩增反应混合物中存在的双链DNA降解。然后在发生逆转录时，通过加热使其失活。因此也描述了这种方法在存在靶双链DNA的情况中的另一种PCR应用，但是限于使用单一类型的限制酶(Type IIS RE)。然而，使用限制酶具有仅使双链脱氧核糖核酸片段化的缺点，所述双链脱氧核糖核酸必须具有所用酶的特定限制位点。因此，没有除去单链形式的和/或具有极少这种限制位点的污染成分。去污染的其它酶促方法包括在与核酸靶位接触之前从溶液中防止不希望的核酸。专利申请WO-A-99/07887描述了在与核酸靶位接触之前使用不耐热的DNase降解反应混合物中包含的双链脱氧核糖核酸。然后通过加热使所述酶失活。这种技术的主要缺点是在反应混合物中通过加热使这种酶失活需要使用耐热聚合酶。此外，反应混合物中存在的试剂也可以由于温度而改变。现有技术还提示处理试剂或者原材料的非酶促方法。因此，Mohammadi T.et al.(J.Clin.Microbiol.；2003；Oct.；41(10):4796-8)描述了一种技术，其包括试剂的柱过滤，用于在扩增之前提取及任选通过限制酶Sau3AI消化PCR试剂。过滤技术的缺点是这些技术不能用于复合的培养基而不改变其浓度或者性质。此外，这种技术不能除去塑料容器上存在的污染物。专利申请WO-A-94/12515描述了使用光反应性化合物处理含有Taq聚合酶及潜在污染核酸的溶液的方法。这种光反应性化合物，如呋喃香豆素(furocoumarin)衍生物，通过暴露于紫外线而活化。除了其限制性应用之外，这种技术的主要缺点是由于所述核酸的随机降解而不是非常有效，以及其可以产生仍可被扩增的片段。这种技术的另一缺点是其仅对使用的Taq聚合酶的酶制备物去污染。核酸扩增方法需要的其它试剂如水、缓冲液、塑料容器等必须通过其它方法去污染。这样需要耗时且可能昂贵的其它操作。由Delehanty J.B.et al.,(RNA.；2005；May；11(5):831-6)描述的另一非酶促方法应用钴复合物以抑制翻译。这种复合物使得DNA和RNA的磷酸二酯键水解。这种技术的主要缺点是核酸的不完全降解以及缓慢的去污染反应(24小时)。本申请人的专利申请WO-A-2008/132412描述了通过金属螯合剂使核苷酸序列失活的方法。在扩增步骤之后，片段化复合物，如双(1,10-菲咯啉)/Cu，用于对溶液存在的所有核酸去污染。这样使得可以避免新样品被得自先前扩增反应的扩增子污染。在第一种应用的情况中，这个方法的主要问题是其未真正使所有污染核酸降解，而仅降解得自先前扩增反应的扩增子。另一方法必须在这个方法上游及并行使用，以除去核酸扩增反应需要的原材料污染。因此仍然需要简便且有效的技术针对感兴趣的核酸处理生物学溶液或者液体生物学样品，以便极大地降低或者甚至消除进行核酸扩增需要的所有试剂以及设备上存在的污染物的影响。这也使得不必使用常规技术对试剂和环境去污染，这些技术非常复杂且通常无效，且存在再污染的危险。本专利技术人因此提议用于处理含有感兴趣的核酸的溶液的一种完全新的方法，其不是对扩增反应的扩增试剂包括原材料直接去污染，而是使扩增绝对特异于初始生物学样品中存在的感兴趣的靶核酸。为此，申请人因此提议使用化学或者酶试剂修饰生物学样品的靶核酸的序列，以转变感兴趣的核酸。这种操作可以就在扩增之前但是在加入扩增需要的试剂进行所述扩增之前进行。然后利用适于特异性杂交于转变的靶的引物和检测探针进行扩增和检测步骤，所述引物和检测探针不特异性杂交于衍生自例如试剂或者水或者塑料容器等的任何污染成分。这种方法使得在提取靶直至对其扩增期间不必对使用的所有试剂和设备进行去污染。根据第一个实施方案，本专利技术涉及一种扩增方法，其用于防止含有感兴趣的希望扩增的核酸的液体生物学样品中的污染物，所述方法包括如下步骤：a)对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，以使得所述感兴趣的核酸的一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基；b)加入扩增引物，用以特异性扩增所述转变的感兴趣的核酸，每种引物由三种不同类型的碱基组成；c)在这些处理之后，向所述生物学样品加入扩增所必需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶，以及预先合成的所述引物；d)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种特异性扩增方法在防止含有希望扩增的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的污染物中的用途，所述方法包括如下步骤：a)对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，以使得所述感兴趣的核酸的一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基；b)加入扩增引物，用以特异性扩增所述转变的感兴趣的核酸，每种引物由三种不同类型的碱基组成，所述引物包含至少一个选自α‑寡核苷酸、PNA、LNA、2'‑O‑烷基核糖核苷酸的修饰的核苷酸；c)在这些处理之后，向所述生物学样品加入扩增所必需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶，以及预先合成的所述引物；d)将所述溶液和试剂置于使得转变的核酸被扩增的条件下，其中所述扩增绝对特异于初始生物学样品中存在的感兴趣的靶核酸。
【技术特征摘要】
2009.01.05 FR 09500131.一种特异性扩增方法在防止含有希望扩增的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的污染物中的用途，所述方法包括如下步骤：a)对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，以使得所述感兴趣的核酸的一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基；b)加入扩增引物，用以特异性扩增所述转变的感兴趣的核酸，每种引物由三种不同类型的碱基组成，所述引物包含至少一个选自α-寡核苷酸、PNA、LNA、2'-O-烷基核糖核苷酸的修饰的核苷酸；c)在这些处理之后，向所述生物学样品加入扩增所必需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶，以及预先合成的所述引物；d)将所述溶液和试剂置于使得转变的核酸被扩增的条件下，其中所述扩增绝对特异于初始生物学样品中存在的感兴趣的靶核酸。2.一种特异性检测方法在防止含有希望扩增及检测的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的污染物中的用途，所述方法包括如下步骤：a)对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，以使得所述感兴趣的核酸的至少一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基；b)加入扩增引物及检测探针，分别用以扩增及检测从感兴趣的核酸的扩增所获得的扩增子，每种引物和探针由三种不同类型的碱基组成，所述引物包含至少一个选自α-寡核苷酸、PNA、LNA、2'-O-烷基核糖核苷酸的修饰的核苷酸；c)向所述生物学样品加入扩增和检测所需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶，以及预先合成的所述引物和探针；d)将所述溶液和试剂置于使得所述转变的核酸被扩增及产生的扩增子被检测的条件下，其中所述扩增绝对特异于初始生物学样品中存在的感兴趣的靶核酸。3.权利要求1或2的用途，特征在于在步骤a)和b)之间进行至少一个纯化步骤。4.权利要求1-3任一项的用途，特征在于在步骤a)之前进行至少一个提取所述液体生物学样品中包含的核酸的步骤。5.权利要求1-4任一项的用途，特征在于所述扩增引物对所述转变的感兴趣的核酸或者与其互补的那些核酸具有特异性。6.权利要求2的用途，特征在于所述检测探针对所述转变的靶和所述扩增子具有特异性。7.权利要求1或2的用途，特征在于所述修饰的核苷酸是2'-O-甲基核糖核苷酸。8.权利要求1-7任一项的用途，特征在于使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的所述化学处理是通过含硫化学剂的作用实现的。9.权利要求1-8任一项的用途，特征在于使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的化学剂含有亚硫酸氢根离子(HSO3-)，如亚硫酸氢钠(NaHSO3)、亚硫酸氢铵(NH4HSO3)、亚硫酸氢镁(MgHSO3)...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·拉尤，A·特勒施，
申请(专利权)人：生物梅里埃公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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