【技术实现步骤摘要】
—种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法及试剂
本专利技术属于人乙型肝炎病毒检测
，涉及一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法及试剂。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)是一种基因组长度约为3200碱基的DNA病毒，由外膜和核衣壳组成。外膜为由HBsAg组成的病毒包膜 。传统诊断HBV感染的方法主要为从血清中用免疫学方法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBCAg、HBcAb，用免疫组化方法原位检测HBV基因产物及HBV DNA的检测。但是，这些方法不能直观反应肝组织中HBV基因表达的实时状态，蛋白的检测也往往具有滞后性。即使HBV DNA的检测，对大部分处于低复制期或无复制期(肝癌晚期和新生儿期)的隐匿性感染也无法诊断。1999年以来，科学家确立了 HBV血清学标志物fRNA和trRNA，提出新的从血清中检测HBV核酸的方法。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法及试剂，该方法适于不同人群HBV fRNA和trRNA的定量检测，具有灵敏度高、特异性强的特点。本专利技术是通过以下技术方案来实现:一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法，包括以下操作:I)第一轮扩增构建fRNA第一轮50ul RT/PCR反应体系:14.Ομ I Η20，10.Ομ I来自待检测对象的核酸提取物，Ι.Ομ I竞争模板19L27，1.5μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1434+，Ομ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1806a, 3.Ομ I 浓度为IOOng/ μ I的引物1808a，5...
【技术保护点】
一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下操作：1)第一轮扩增构建fRNA第一轮50ul RT/PCR反应体系：14.0μl H2O，10.0μl来自待检测对象的核酸提取物，1.0μl竞争模板19L27，1.5μl浓度为100ng/μl的引物1434+，3.0μl浓度为100ng/μl的引物1806a，3.0μl浓度为100ng/μl的引物1808a，5.0μl浓度为10mM的dNTP，2.5μl浓度为100mM的DTT溶液,10.0μl5×RT/PCR buffer，1.0μl RNA聚合酶；所述的引物1434+为：TCTCATCTGCCGGACCGTGT；所述的引物1806a为：(T)15AGCTC；所述的引物1808a为：(T)15GAAGC；构建trRNA第一轮50ulRT/PCR反应体系：17.0μl H2O，10.0μl来自待检测对象的核酸提取物，1.0μl竞争模板J166(16)，1.5μl浓度为100ng/μl的引物1445+，3.0μl浓度为100ng/μl的引物1683a,5.0μl浓度为10mM的dNTP，2.5μl浓度为100mM的DTT溶液...
【技术特征摘要】
1.一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下操作: .1)第一轮扩增 构建fRNA第一轮50ul RT/PCR反应体系: .14.0 μ I H20,10.0 μ I来自待检测对象的核酸提取物，1.0 μ I竞争模板19L27，1.5μ I浓度为IOOng/μ I的引物1434+，3.0μ I浓度为IOOng/μ I的引物1806a，3.0μ I浓度为 IOOng/μ I 的引物 1808a，5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，2.5μ I 浓度为 IOOmM 的 DTT 溶液，10.0 μ 15 X RT/PCR buffer, 1.0 μ I RNA 聚合酶； 所述的引物 1434+ 为:TCTCATCTGCCGGACCGTGT ； 所述的引物1806a为:(T) 15AGCTC ； 所述的引物1808a为:(T) 15GAAGC ； 构建trRNA第一轮50ulRT/PCR反应体系: .17.0μ I H20,10.0μ I来自待检测对象的核酸提取物，1.0μ I竞争模板J166(16)，.1.5μ I 浓度为 lOOng/μ I 的引物 1445+，0μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1683a，5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，2.5μ I 浓度为 IOOmM 的 DTT 溶液，10.0 μ 15 X RT/PCR buffer, .1.0μ IRNA聚合酶；所述的引物 1445+ 为:GGACCGTGGCACTTCGCTT ； 所述的引物1683a为:(T) 15CGTGG ； 将构建的fRNA第一轮50ul RT/PCR反应体系、trRNA第一轮50ulRT/PCR反应体系分别按照以下RT/PCR程序进行半巢式扩增: . 5(TC孵育 20min ;93°C变性 lmin40sec ;DNA扩增为 9(TC 40sec, 53°C 50sec, 70°C .40sec,.35个循环；70°C 15min后冷却至4°C ； .2)第二轮扩增 构建fRNA第二轮反应体系: .31.Ομ I H2O ; 5.Ομ I 第一轮 fRNA 扩增产物，0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1464+，.0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1806a-0,0.75 μ I 浓度为 lOOng/μ I 的引物 .1808a-，.5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，l.5μ I 浓度为 50mM 的 MgCl2 溶液，5.0 μ I PCR buffer, 0.25 μ ITaq DNA聚合酶； 构建trRNA第二轮反应体系: .31.75 μ I Η20，5.0μ I 第一轮 trRNA 扩增产物，0.75 μ I 浓度为 lOOng/μ I 的引物.1464+,0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1683a，5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，l.5μ .1 浓度为 50mM 的 MgCl2 溶液，5.0 μ I PCR buffer, 0.25 μ I Taq DNA 聚合酶； 所述的引物 1464+ 为:TCACCTCTGCACGTCGCATG ； 所述的引物1683a为:(T) 15CGTGG ； 将构建的fRNA第二轮反应体系、trRNA第二轮反应体系分别按照以下RT/PCR程序进行半巢式扩增: . 93 O 变性 lmin40sec ;DNA 扩增为 90 °C 40sec,53 °C 50sec,70 °C 40sec，35 个循环；.70 °C 15min 后冷却至 4°C ； .3)琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物 在第二轮扩增完成之后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，同时添加一定浓度的竞争模板作为对照；比较扩增产物与竞争模板条带的信号值，如果两者信号值相当则表明待测对象中fRNA、trRNA的浓度与竞争模板的浓度相当；如果两者的信号值不相当，则增加或稀释琼脂糖凝胶电泳时竞争...
【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，李艳红，张佳瑞，巩丽，朱少君，韩秀娟，姚丽，王姝妹，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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