乙型肝炎病毒P区变异及其用途制造技术

本发明专利技术涉及乙型肝炎病毒P区变异及其用途。本发明专利技术首次揭示了乙型肝炎病毒P区多个位点上的碱基突变与肝癌的发生密切相关，可将这些位点的变异作为肝癌易感性标志。本发明专利技术还提供了可特异性检测所述突变位点的试剂或试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及乙型肝炎病毒P区变异及其用途。本专利技术首次揭示了乙型肝炎病毒P区多个位点上的碱基突变与肝癌的发生密切相关，可将这些位点的变异作为肝癌易感性标志。本专利技术还提供了可特异性检测所述突变位点的试剂或试剂盒。【专利说明】
本专利技术属于生物
；具体地说，本专利技术涉及乙型肝炎病毒P区变异；基于这 些变异情况，本专利技术提供了可用于肝癌预测以及早期（辅助性）诊断的检测试剂或试剂盒。 乙型肝炎病毒P区变异及其用途
技术介绍
原发性肝细胞肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，已占居民肿瘤死亡的第二位。乙型 肝炎病毒（HBV)慢性感染是导致我国肝癌发生的首要原因。我国约有HBV表面抗原（HBsAg) 携带者1. 2亿，他们中相当部分的慢性肝炎患者，经10?20年的发展会进入肝硬化状态， 而肝硬化患者中每十年即有30?50%的人将演变成肝癌。近年来，随着乙肝疫苗的普遍应 用，我国儿童中肝炎的发病得到了很好的控制。但在那些已经感染了乙肝病毒的人群中，肝 癌的发病率和死亡率却仍然呈上升趋势。 乙型肝炎病毒属于嗜肝性DNA病毒科，其基因组为部分环状双链DNA，约3200bp， 由正链和负链构成（图1)。负链含有4个开放读码框（Open Reading Frame, 0RF):前S/ S区、X区、P区（聚合酶）以及P区（precore/core，pre-C/C);除此之外还有多个基因表 达调控序列，包括2个直接重复序列（DRI、DRII)、2个增强子（ENI、ENII)和4个启动子 (SP1、SP2、XP和CP)。HBV前S/S区包括前S1基因、前S2基因和S基因，分别编码病毒包 膜大蛋白（400aa)、中蛋白（271aa)和小蛋白（226aa) ;X区编码HBV X蛋白；HBV的前C基 因及C基因则共享另一个开放读码框P区，根据不同的起始密码子，分别编码病毒核心抗原 (Hepatitis B Core Antigen，HBcAg)和 e 抗原（Hepatitis B e Antigen，HBeAg), P 区编 码DNA聚合酶。 P基因是最长的开放读框，与C、S与X基因重叠，具体的碱基相对位置见图2。P基 因主要编码HBV聚合酶。HBV聚合酶是乙肝病毒复制的物质基础。根据功能的不同，HBV聚 合酶从氨基端开始分为四个区，分别为末端蛋白区（TP)、间隔区（SD)、逆转录酶区（RT)和 RNase Η区。其中逆转录酶RT区是HBVDNA聚合酶的主要功能区，同时具有反转录酶及DNA 聚合酶活性，作用是将前基因组RNA反转录成负链HBV DNA，并以此负链DNA为模板合成正 链DNA。HBV的逆转录酶区可进一步分为五个主要的功能域，Α区（421?436氨基酸）、Β区 (506?528氨基酸）、C区（546?550氨基酸）、D区（576?589氨基酸）及Ε区（592? 600氨基酸）。这五个区域的氨基酸高度保守，为维持反转录酶活性所必须，其中A、C、D区 为聚合酶与三磷酸核苷结合的结合域，B、E区为RNA模板和引物定位域。目前临床应用的 拟核苷类药物主要的靶位点位于逆转录酶RT区的B及C区，HBV多聚酶的催化域即位于C 区的YMDD基序。也是拉米夫定等抗病毒药物治疗时HBV最常出现变异的区域。P基因变 异主要见于P0L/RT基因片段（349?692aa，即rtl?rt344)。在拉米夫定的抗病毒治疗 中，最常见的是酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸（YMDD)变异，即由YMDD变异为 YIDD (rtM204I)或YVDD (rtM204V)，并常伴有rtL180M变异，且受药物选择而逐渐成为对拉 米夫定耐药的优势株。较早的研究报道，多为P基因与拉米夫定等核苷酸耐药有关系，P基 因与肝癌的发生关系至今仍很少报道。 目前常用的基因突变检测方法包括限制性片段长度多态性（RFLP)，单链构象多态 性（PCR-SSCP)，基因芯片及DNA序列测定技术。PCR-SSCP用于检测基因突变操作繁琐、检 测通量低，而且不能判断特异性位点的突变形式。而RFLP是使用核酸内切酶对扩增后的靶 序列特异性位点的切割，然后通过电泳检测判断不同的基因型，但是由于HBV基因组分子 进化速度较快、变异频繁，因此结果分析准确率较低。近年来，基因芯片技术已成功应用于 核酸分析，对检测HBV基因组多态性具有很大的优势，但因其检测费用昂贵而限制了该技 术在临床实验室的推广和应用。因此，本领域有必要开发优化的且切实可推广应用的临床 检测技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供乙型肝炎病毒P区变异及其用途。 本专利技术的目的还在于提供用于肝癌预测以及早期（辅助性）诊断的检测试剂或试 剂盒。 在本专利技术的第一方面，提供一种检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒P区变异 的试剂盒，它包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第1055位碱基序列的引物；和/或 与乙型肝炎病毒P区第1055位为碱基"A"的序列结合的探针。 在一个优选例中，所述的试剂盒还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第987位碱基序列的引物；和/或 与乙型肝炎病毒P区第987位为碱基"G"的序列结合的探针。 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第799位碱基序列的引物；和/或 与乙型肝炎病毒P区第799位为碱基"G"的序列结合的探针。 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第904位碱基序列的引物；和/或 与乙型肝炎病毒P区第904位为碱基"T"的序列结合的探针。 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第955位碱基序列的引物；和/或 与乙型肝炎病毒P区第955位为碱基"T"的序列结合的探针。 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第1229位碱基序列的引物；和/或 与乙型肝炎病毒P区第1229位为碱基"A"的序列结合的探针。 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第1230位碱基序列的引物；和/或 与乙型肝炎病毒P区第1230位为碱基"G"的序列结合的探针。 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第2489位碱基序列的引物；和/或 与乙型肝炎病毒P区第2489位为碱基"A"的序列结合的探针。 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第294位碱基序列的引物；和/或 与乙型肝炎病毒P区第294位为碱基"A"的序列结合的探针。 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括： 扩增含有乙型肝炎病毒P区第895位碱基序列的引物；和/或 与乙型肝炎病毒P区第895位为碱基"A"的序列结合的探针。 在另一优选例中，所述的引物包括： SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24和SEQ ID N0:25所示序列的引物对，用于扩增含有 乙型肝炎病毒P区第799、895、904、955、987、1055、1229或1230位碱基的序列；和/或 SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:27和SEQ ID N0:28所示序列的引物对，用于扩增含有 乙型肝炎病毒P区第294位碱基的序列；和/或 SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30和S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒P区变异的试剂盒，其特征在于，它包括：扩增含有乙型肝炎病毒P区第1055位碱基序列的引物；和/或与乙型肝炎病毒P区第1055位为碱基“A”的序列结合的探针。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：屠红，赵芝梅，金晏，高付敏，陈陶阳，吴燕，甘愉，
申请(专利权)人：上海市肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31