【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白检测，具体涉及一种基于dna纳米花级联crispr系统的蛋白标志物检测平台及其构建方法和应用。
技术介绍
1、临床组织和液体样本中的蛋白质标志物是反映疾病进展程度的重要指标。灵敏并准确地检测蛋白质标志物对于疾病管理中的及时干预和预后判断至关重要。迄今为止，蛋白质标志物通常通过免疫组织化学（ihc）、酶联免疫吸附试验（elisa）、和免疫印迹技术进行分析和定量。然而，在成分复杂的真实临床样本中，受限于蛋白质标志物信号的高效放大，准确、灵敏、快速地检测蛋白质生物标志物仍是一大挑战。同时，随着健康管理需求的不断增加，迫切需要开发真实样本中蛋白质标志物的放大方法，以用于临床疾病的早期诊断和预后评估。
2、近十年来兴起的crispr/cas系统因其对核酸的特异性识别和顺式、反式裂解活性，被广泛应用于核酸、蛋白质和小分子标志物的检测，为crispr/cas生物技术进入临床应用打开了大门。尽管 crispr/cas系统具有多次翻转的反式裂解特性，可以放大输出信号，但目前基于 crispr 的检测平台仍需要与非等温聚合酶链反应（pcr）和等温重组酶聚合酶扩增（rpa）等前扩增技术相结合，才能实现检测靶核酸的高灵敏度和特异性。然而，对于非核酸标记物（如蛋白质标志物），目前还没有直接的预扩增技术，阻碍了 crispr 系统在蛋白质标志物方面的转化应用。因此，开发高效的蛋白质标志物预扩增技术，并与 crispr/cas系统耦合，对于在成分复杂的真实临床样本中灵敏、准确地检测蛋白质标志物至关重要。
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1、本专利技术的目的之一是为了解决上述技术问题，提供一种基于dna纳米花级联crispr系统的蛋白标志物检测平台（dnf-crispr），该检测平台通过利用dna纳米花对蛋白标志物输入信号进行上游放大（高效的实现了蛋白质标志物的预扩增技术），再利用crispr系统对输出信号进行下游放大，从而实现生物信号输入和输出级联放大，通过这种上、下游级联放大，实现对蛋白标志物超灵敏、高特异性检测，是一个通用性的蛋白标志物检测平台，在医学诊断和食品安全等领域具有广阔应用前景。
2、本专利技术的目的之二是提供上述的一种基于dna纳米花级联crispr系统的蛋白标志物检测平台的构建方法。
3、本专利技术的目的之三是提供上述的一种基于dna纳米花级联crispr系统的蛋白标志物检测平台的在蛋白标志物检测中的应用方法，通过该应用方法，可以实现对蛋白标志物超灵敏、高特异性检测，检测限可达500 fg/ml。
4、本专利技术的技术原理
5、根据蛋白标志物设计dna纳米花上成千上百的核酸能够被cas-crrna复合物识别并激活cas蛋白顺式和反式切割活性，对dnf进行顺式切割，同时对两端分别标记荧光猝灭对的报告链进行反式切割，释放荧光信号。
6、本专利技术的技术方案
7、一种基于dna纳米花级联crispr系统的蛋白标志物检测平台，包括利用dna纳米花放大蛋白标志物输入信号的上游模块，和利用crispr系统放大蛋白标志物输出信号的下游模块；
8、上述的利用dna纳米花放大蛋白标志物输入信号的上游模块包括：抗体对、单链dna、偶联剂、用于制备具有重复的扩增链的dna纳米花的模板链和引物链；
9、所述抗体对为蛋白标志物的捕获抗体和检测抗体；
10、所述单链dna的序列为seq id no.1；
11、所述dna纳米花上的扩增链序列为seq id no.2；
12、所述引物链的序列为seq id no.3；
13、所述模板链的序列为seq id no.4；
14、所述偶联剂为sulfo-smcc；
15、上述的利用crispr系统放大输出信号的下游模块包括：crrna、cas蛋白、两端分别修饰荧光和猝灭基团的报告链；
16、所述crrna的序列为seq id no.5；
17、所述报告链的序列为tttttt；
18、优选的，所述的利用dna纳米花放大蛋白标志物输入信号的上游模块中，还包括用于dna纳米花制备所用的t4 dna连接酶、equiphi29 dna聚合酶、dntp、dtt、equiphi29缓冲液；
19、优选的，利用crispr系统放大输出信号的下游模块中，所述的cas蛋白为cas12a或cas14；
20、所述的两端分别修饰荧光和猝灭基团的报告链中，荧光基团为荧光基团为5-羧基荧光素（fam）、花青素3（cy3）或花青素5（cy5），猝灭基团为黑孔猝灭剂1（bhq1）、黑孔猝灭剂2（bhq2）或黑孔猝灭剂3（bhq3）。
21、一种基于dna纳米花级联crispr系统的蛋白标志物检测平台的构建方法，包括如下步骤：
22、（1）、基于dna纳米花对蛋白标志物的输入信号进行放大的上游模块，包括如下构建步骤：
23、①、根据需要检测的蛋白标志物，选择特异性结合的抗体对（捕获抗体和检测抗体）；其中捕获抗体用于包被微孔板，对蛋白标志物进行特异性捕获结合；其中检测抗体通过偶联剂与单链dna偶联形成抗体-dna偶联物（ab-oligo）；
24、所述单链dna的序列为seq id no.1；
25、所述偶联剂为sulfo-smcc；
26、所述捕获抗体包被浓度为8 μg/ml，4℃下过夜包被；
27、所述检测抗体与sulfo-smcc偶联剂的摩尔浓度比为1:100，反应浓度为6 μg/ml，在4℃下反应30min，与单链dna的摩尔浓度比为1:4，在37℃下反应4h；
28、②、设计能够与单链dna杂交互补的扩增链及对应的引物链和模板链。模板链和引物链在equiphi29 dna 聚合酶作用下发生滚环扩增反应，生成具有重复扩增链序列的dna纳米花，合成的dna纳米花作为上游模块；
29、dna纳米花上的扩增链序列为seq id no.2；
30、所述引物链的序列为seq id no.3；
31、所述模板链的序列为seq id no.4；
32、所述滚环扩增的反应时间为2-6h，反应温度为37-42℃，equiphi29 dna聚合酶工作浓度为10 u /μl；
33、所述滚环扩增终止后，反应液10000 rpm离心4min，保留下层沉淀，在milli-q水中重悬，重复3次后获得dna纳米花，将dna纳米花分散于milli-q水中，4℃保存备用；
34、上述所得的dna纳米花呈球形花状形态，直径约200-800nm，优选为200-650 nm；
35、③、抗体-dna偶联物的抗体检测到目标蛋白后，另一端单链dna与dna纳米花杂交（杂交序列为：seq id no.1与seq id no.2杂交），从而将蛋白生物信号转化成dna纳米花上重复扩增链信号，实现本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于DNA纳米花级联CRISPR系统的蛋白标志物检测平台，其特征在于，所述的基于DNA纳米花级联CRISPR系统的蛋白标志物的检测平台，包括利用DNA纳米花放大蛋白标志物输入信号的上游模块，和利用CRISPR系统放大蛋白标志物输出信号的下游模块；
2.如权利要求1所述的基于DNA纳米花级联CRISPR系统的蛋白标志物的检测平台，其特征在于，所述的利用DNA纳米花放大蛋白标志物输入信号的上游模块中，还包括用于DNA纳米花制备所用的T4 DNA连接酶、EquiPhi29 DNA聚合酶、dNTP、DTT、EquiPhi29缓冲液。
3.如权利要求1所述的基于DNA纳米花级联CRISPR系统的蛋白标志物的检测平台，其特征在于：
4.权利要求1、2或3所述的一种基于DNA纳米花级联CRISPR系统的蛋白标志物的检测平台的构建方法，其特征在于包括如下构建步骤：
5.如权利要求4所述的基于DNA纳米花级联CRISPR系统的蛋白标志物的检测平台的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述DNA纳米花是在EquiPhi29 DNA 聚合酶作用下发生
6.如权利要求4所述的基于DNA纳米花级联CRISPR系统的蛋白标志物的检测平台的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述DNA纳米花为滚环扩增反应结束后经物理机械破坏、反复洗涤离心重悬所得。
7.如权利要求4所述的基于DNA纳米花级联CRISPR系统的蛋白标志物的检测平台的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述DNA纳米花呈球形花状形态，直径约200-800 nm。
8.权利要求1、2或3所述的基于DNA纳米花级联CRISPR系统的蛋白标志物的检测平台在蛋白标志物检测中的应用。
9.如权利要求8所述的基于DNA纳米花级联CRISPR系统的蛋白标志物的检测平台在蛋白标志物检测中的应用，其特征在于，所得的DNA纳米花作为输入信号放大的上游模块，Cas-crRNA复合物并将其作为下游模块。
10.如权利要求9所述的基于DNA纳米花级联CRISPR系统的蛋白标志物的检测平台在蛋白标志物检测中的应用，其特征在于，所述的Cas12a-crRNA复合物被蛋白标志物对应的DNA纳米花激活后，反式切割报告链，利用这种级联放大原理实现对蛋白标志物的检测应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于dna纳米花级联crispr系统的蛋白标志物检测平台，其特征在于，所述的基于dna纳米花级联crispr系统的蛋白标志物的检测平台，包括利用dna纳米花放大蛋白标志物输入信号的上游模块，和利用crispr系统放大蛋白标志物输出信号的下游模块；
2.如权利要求1所述的基于dna纳米花级联crispr系统的蛋白标志物的检测平台，其特征在于，所述的利用dna纳米花放大蛋白标志物输入信号的上游模块中，还包括用于dna纳米花制备所用的t4 dna连接酶、equiphi29 dna聚合酶、dntp、dtt、equiphi29缓冲液。
3.如权利要求1所述的基于dna纳米花级联crispr系统的蛋白标志物的检测平台，其特征在于：
4.权利要求1、2或3所述的一种基于dna纳米花级联crispr系统的蛋白标志物的检测平台的构建方法，其特征在于包括如下构建步骤：
5.如权利要求4所述的基于dna纳米花级联crispr系统的蛋白标志物的检测平台的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述dna纳米花是在equiphi29 dna 聚合酶作用下发生滚环扩增反应形成，反应时间为2-6小时，...
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