一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本中病毒的cDNA；(3)检测：进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有口蹄疫病毒。本发明专利技术还公开了特异性引物(如SEQ ID NO.1～8所示)以及试剂盒(由特异性引物、RT反应缓冲液、AMV反转录酶、 Premix Ex TaqTM II、标准阳性质粒、无RNase的水组成)。本发明专利技术的检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法及试剂盒既可用于养殖场气溶胶的口蹄疫病毒检测和血清型分型，也可用于临床样本的直接检测，还可用于科学研究等非疾病的诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法及试剂盒
本专利技术涉及一种通过荧光定量SYBR Green I方法分型检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，以及特异性引物、试剂盒，属于生物检测领域。
技术介绍
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的猪、牛、羊等偶蹄类动物发生急性、热性、高度接触性传染病，一旦暴发，必须扑杀感染及接触感染的动物。口蹄疫被世界动物卫生组织列为法定报告疫病，被我国列为一类动物疫病之首，不仅会造成巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。口蹄疫病毒有7个血清型和65个以上的血清亚型，血清型之间无交叉免疫现象，因而难以控制。我国为口蹄疫流行国家，主要流行O型、A型和Asial型口蹄疫。2005年我国大面积爆发了 Asial型口蹄疫，2009年和2013年爆发了 A型口蹄疫，近年来，均有O型口蹄疫的散发和流行，特别是随着我国养殖业集约化、规模化的迅猛发展，口蹄疫的传播风险也来越大。由于养殖动物高度密集，患病动物呼出、排泄大量的病原微生物，造成舍内高浓度微生物气溶胶的积聚，而且通过舍内外气体的交换，病原微生物随着大气传播、扩散，造成环境生物污染和传染病传播。口蹄疫病毒能在空气中形成气溶胶，病毒可随风散播到50~100公里外的地方，传播速度快，距离远，难于防御。因此，通过建立一种适用于口蹄疫病毒气溶胶的检测方法， 将为口蹄疫预报预警提供配套技术。目前应用于气溶胶病毒的检测方法主要有培养法和分子生物学方法，实时突光定量PCR是目前确定样品中DNA (或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的分子生物学方法，具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，可应用于病原微量检测。然而关于气溶胶的口蹄疫病毒突光定量PCR检测及其分型方法未见报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种通过荧光定量SYBRGreenI方法分型检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，以及特异性引物、试剂盒。本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，步骤如下:(I)采集气溶胶样本；进一步地，采集气溶胶样本的方法为:采用MS-1型多功能微生物采样器，以IOmLpH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集30min，收集养殖场环境中的气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本中病毒的cDNA ；进一步地，提取cDNA的方法为:取2mL气溶胶样本，应用病毒RNA提取试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取总RNA ;再参照反转录试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)说明书进行反转录，获得cDNA ;(3)检测:以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreen I实时荧光定量PCR,具体如下:所述试剂盒由特异性引物、RT反应缓冲液、AMV反转录酶、SYBfT Premix Ex Taq?I1、标准阳性质粒、无RNase的水组成。所述标准阳性质粒包括阳性质粒pEASY-T3-5’ UTR、pEASY-T3-0_VPl、PEASY-T3-A-VP1和pEASY_T3-Al_VPl ;用于标准曲线的制备及气溶胶口蹄疫病毒拷贝数的计算。所述阳性质粒pEASY-T3-5’UTR是由SEQ ID N0.9所示序列的第28-203位核苷酸的序列片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。所述阳性质粒pEASY-T3-0-VPl是由ID N0.10所示的序列片段与pEASY_T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。所述阳性质粒pEASY-T3-A-VPl是由SEQ ID N0.11所示的序列片段与pEASY_T3载体相连接后 得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。所述阳性质粒pEASY-T3-Al-VPl是由SEQ ID N0.12所示的序列片段与pEASY_T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。所述特异性引物选自口蹄疫病毒检测的通用引物对或/和O型、A型、Asial型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对；所述口蹄疫病毒检测的通用引物对的序列如下:引物1-5，UTR-F:5，-CGTTGCACTCCACACTTAC-3，(SEQ ID N0.1)；引物2-5，UTR-R:5，-GACCAAGTAGGCGGAAAG-3，(SEQ ID N0.2)；O型、A型、Asial型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下:O型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下:引物3-0-VP1F:5，-GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC-3’ (SEQ ID N0.3)；引物4-0-VP1R:5，-CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC-3’ (SEQ ID N0.4)；A型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下:引物5-A-VP1F:5，-AGACACAGGCTCAGCGACGTC-3’ (SEQ ID N0.5)；引物6-A-VP1R:5，-GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC-3’ (SEQ ID N0.6)；Asial型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下:引物7-A1-VP1F:5，-GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC-3，(SEQ ID N0.7)；引物8-A1-VP1R:5，-CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC-3’ (SEQ ID N0.8)。扩增反应体系为:20yL的扩增体系，包括2XSYBR Premix Ex Taq IIlOyL,10 μ mo I/L的上游引物和下游引物各0.5 μ L，阳性质粒I μ L，RNaseFreeddH2O补足20 μ L。扩增条件为:预变性95 °C 30s，然后按照95°C变性5s、65°C退火延伸30s，进行40个循环；溶解曲线为95°C 5s,65°C 60s,95°C Continuous ;最后50°C 30s结束反应。(4)建立标准曲线和溶解曲线:建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断:当所用特异性引物为口蹄疫病毒检测的通用引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有口蹄疫病毒；当所用特异性引物为O型、A型、Asial型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对时，若对应于O型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有O型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有O型口蹄疫病毒；若对应于A型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有A型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有A型口蹄疫病毒；若对应于Asial型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有Asial型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，贝1J表明气溶胶样本中不含有Asial型口蹄疫病毒。本专利技术的检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法及试剂盒既可用于养殖场气溶胶的口蹄疫病毒检测和血清型分型，也可用于临床样本的直接检测，还可用于科学研究等非疾病的诊断。【附图说明】图1: 口蹄疫病毒SYBRGreenI实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，其特征在于：步骤如下：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本中病毒的cDNA；(3)检测：以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：所述试剂盒由特异性引物、RT反应缓冲液、AMV反转录酶、Premix Ex TaqTM II、标准阳性质粒、无RNase的水组成；所述标准阳性质粒包括阳性质粒pEASY‑T3‑5’UTR、pEASY‑T3‑O‑VP1、pEASY‑T3‑A‑VP1和pEASY‑T3‑A1‑VP1；所述阳性质粒pEASY‑T3‑5’UTR是由SEQ ID NO.9所示序列的第28‑203位核苷酸的序列片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒；所述阳性质粒pEASY‑T3‑O‑VP1是由ID NO.10所示的序列片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒；所述阳性质粒pEASY‑T3‑A‑VP1是由SEQ ID NO.11所示的序列片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒；所述阳性质粒pEASY‑T3‑A1‑VP1是由SEQ ID NO.12所示的序列片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒；所述特异性引物选自口蹄疫病毒检测的通用引物对或/和O型、A型、Asia1型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对；所述口蹄疫病毒检测的通用引物对的序列如下：引物1‑5’UTR‑F：5’‑CGTTGCACTCCACACTTAC‑3’；引物2‑5’UTR‑R：5’‑GACCAAGTAGGCGGAAAG‑3’；O型、A型、Asia1型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下：O型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下：引物3‑O‑VP1F：5’‑GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC‑3’；引物4‑O‑VP1R：5’‑CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC‑3’；A型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下：引物5‑A‑VP1F：5’‑AGACACAGGCTCAGCGACGTC‑3’；引物6‑A‑VP1R：5’‑GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC‑3’；Asia1型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下：引物7‑A1‑VP1F：5’‑GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC‑3’；引物8‑A1‑VP1R：5’‑CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC‑3’；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断：当所用特异性引物为口蹄疫病毒检测的通用引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有口蹄疫病毒；当所用特异性引物为O型、A型、Asia1型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对时，若对应于O型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有O型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有O型口蹄疫病毒；若对应于A型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有A型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有A型口蹄疫病毒；若对应于Asia1型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有Asia1型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有Asia1型口蹄疫病毒。...

【技术特征摘要】
1.一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，其特征在于:步骤如下: (1)采集气溶胶样本； (2)提取气溶胶样本中病毒的cDNA； (3)检测:以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR,具体如下: 所述试剂盒由特异性引物、RT反应缓冲液、AMV反转录酶、SYBIf Premix Ex Taq? I1、标准阳性质粒、无RNase的水组成； 所述标准阳性质粒包括阳性质粒 pEASY-T3-5’ UTR、pEASY-T3-0_VPl、pEASY-T3-A_VPl和 pEASY-T3-Al-VPl ； 所述阳性质粒pEASY-T3-5’UTR是由SEQ ID N0.9所示序列的第28-203位核苷酸的序列片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒； 所述阳性质粒PEASY-T3-0-VP1是由ID N0.10所示的序列片段与pEASY_T3载体相连接后得到的重组质粒； 所述阳性质粒PEASY-T3-A-VP1是由SEQ ID N0.11所示的序列片段与pEASY_T3载体相连接后得到的重组质粒；所述阳性质粒PEASY-T3-A1-VP1是由SEQ ID N0.12所示的序列片段与pEASY_T3载体相连接后得到的重组质粒； 所述特异性引物选自口蹄疫病毒检测的通用引物对或/和O型、A型、Asial型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对； 所述口蹄疫病毒检测的通用引物对的序列如下:引物 1-5，UTR-F:5’ -CGTTGCACTCCACACTTAC-3，；引物 2-5’ UTR-R:5’ -GACCAAGTAGGCGGAAAG-3’ ； O型、A型、Asial型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下: O型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下:引物 3-0-VP1F:5’ -GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC-3’ ；引物 4-0-VP1R:5’ -CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC-3’ ； A型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下:引物 5-A-VP1F:5’ -AGACACAGGCTCAGCGACGTC-3’ ；引物 6-A-VP1R:5，-GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC-3，； Asial型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下:引物 7-A1-VP1F:5’ -GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC-3’ ；引物 8-A1-VP1R:5’ -CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC-3’ ； (4)建立标准曲线和溶解曲线:建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线； (5)判断:当所用特异性引物为口蹄疫病毒检测的通用引物对时，若溶解曲线为S型曲线，贝1J表明气溶胶样本中含有口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，贝1J表明气溶胶样本中不含有口蹄疫病毒； 当所用特异性引物为O型、A型、Asial型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对时，若对应于O型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有O型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有O型口蹄疫病毒；若对应于A型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有A型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有A型口蹄疫病毒；若对应于Asial型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有Asial型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线,贝U表明气溶胶样本中不含有Asial型口蹄疫病毒。2.根据权利要求1所述的检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，其特征在于:所述步骤(1)中，采集气溶胶样本的方法为:采用MS-1型多功能微生物采样器，以IOmLpH值7.0的磷酸盐缓冲液为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集30min，收集气溶胶样本。3.根据权利要求1所述的检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，提取cDNA的方法为:取2mL气溶胶样本，应用病毒RNA提取试剂盒提取总RNA ;再应用反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。4.根据权利要求1所述的检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，PCR的扩增反应体系为:20μ L的扩增体系，包括2XSYBR Premix Ex Taq IIlOyL,10 μ mo ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪梅，何洪彬，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37