一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒荧光定量检测试剂盒和检测方法。该检测试剂盒和检测方法是根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ORF007基因保守区序列设计特异引物和探针。本发明专利技术采用荧光定量PCR技术，简便快捷、灵敏度高、特异性强、重复性好，可运用于鳜鱼的传染性脾肾坏死病毒病毒监测，也可以对鳜鱼中病毒的含量和病毒滴度进行检测。

【技术实现步骤摘要】
—种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，具体涉及一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
鳜鱼(Siniperca chuatsi)是我国重要的淡水鱼特色养殖种类之一，由传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)引起的績鱼虹彩病毒病是鳜鱼养殖的主要疫病，导致鳜鱼死亡率接近100%，成为制约鳜鱼养殖业发展的主要瓶颈。1997年，吴淑勤等首先在患病鳜鱼中发现了直径150nm的球形病毒，并认为是鳜鱼暴发性传染病的病原。何建国等通过回归感染进一步证明了该病毒的病原性，通过组织学研究发现鳜鱼脾脏和肾脏是其感染的主要器官，将其命名为传染性脾肾坏死病毒，通过主衣壳蛋白(MCP)基因等序列分析确定其为一种虹彩病毒。虹彩病毒是二十面体的胞质DNA病毒，直径一般在120_200nm之间，可以感染节肢动物等无脊椎动物和鱼类、两栖、爬行等冷血脊椎动物。根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)第八次报告，虹彩病毒科(Iridoviridae)下设虹彩病毒属(Iridovirus)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)、娃病毒属(Ranavirus)、淋巴囊肿病毒属(LympHocystivirus)和肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)五个属，其中传染性脾肾坏死病毒是肿大细胞病毒属的代表种。由于肿大细胞病毒属病毒对鱼类养殖业的巨大危害，这个属的病毒受到越来越多的重视，目前已有数十种肿大细胞病毒属 病毒被发现。但还未见荧光定量PCR应用于鳜鱼传染性脾肾坏死病毒检测的报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种鳜传染性脾肾坏死病毒的突光定量PCR检测试剂盒。本专利技术的另一个目的是提供一组用于检测鳜传染性脾肾坏死病毒的荧光定量PCR特异性引物及探针。本专利技术的另一个目的是提供一种鳜传染性脾肾坏死病毒的荧光定量PCR检测方法。本专利技术的另一个目的是提供一种鳜传染性脾肾坏死病毒滴度的荧光定量PCR检测方法。本专利技术所采取的技术方案是: 一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括如下组分:针对鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的特异性引物及探针、荧光定量反应液、Tap酶。所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的特异性引物及探针是根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒0RF007基因保守区序列设计的。作为优选的，所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的特异性引物及探针的序列如下所示:ISKNV-F: 5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’ (SEQ ID NO:1);ISKNV-R: 5’-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ (SEQ ID NO:2);ISKNV-P:5’-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT- Eclipse-3’ (SEQ ID NO:3)。所述试剂盒中还含有阳性标准品，所述阳性标准品为含有鳜传染性脾肾坏死病毒DNA的质粒。一组用于检测鳜传染性脾肾坏死病毒的荧光定量PCR特异性引物及探针，序列如下所述ISKNV -F: 5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’ (SEQ ID NO:1);ISKNV-R: 5’-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ (SEQ ID NO:2); ISKNV-P:5’-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT- Eclipse-3’ (SEQ ID NO:3)。一种鳜传染性脾肾坏死病毒滴度的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤: (O以鳜鱼传染性脾肾坏死病毒0RF007基因保守区序列作为PCR扩增的靶序列，设计合成特异性引物和探针； (2)建立质粒拷贝数与CT值对应关系的标准曲线； (3)利用步骤(1)的特异性引物和探针对鳜鱼传染性脾肾坏死坏死病毒滴度进行荧光定量PCR检测，根据检测CT值，结合标准曲线计算出鳜传染性脾肾坏死病毒滴度与拷贝数的对应关系。所述特异性引物和探针的序列如下所示:ISKNV - F:5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’ (SEQ ID NO:1);ISKNV-R:5’-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ (SEQ ID NO:2);ISKNV-P:5’-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT-Eclipse-3’ (SEQ ID NO:3)。本专利技术的有益效果是: 本专利技术的有益效果在于可对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病进行快速检测，可以做到对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病定量分析，而且可以简化操作程序、节约成本，对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病的流行病学调查、病原监测及早期预警都具有重要的意义。【附图说明】图1为本专利技术的荧光定量PCR检测方法检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病的灵敏度实验图，从左到右依次为 I X 108、I X 107、I X IO6、I X 105、I X IO4、I X 103、I X IO2、1X10 拷贝/μ L的标准品的扩增结果； 图2为本专利技术荧光定量PCR检测方法的特异性实验图； 图3为本专利技术荧光定量PCR检测方法中质粒拷贝数与CT值对应关系的标准曲线； 图4为本专利技术荧光定量PCR检测方法的重复性实验图； 图5为本专利技术荧光定量PCR检测方法中的样品检测实验图； 图6为本专利技术荧光定量PCR检测方法中拷贝数与病毒滴度关系图。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1、特异性引物及探针的设计 根据从Genbank上检索到的鳜传染性脾肾坏死病毒0RF007蛋白核酸序列(NC_003494)，通过blast比对，在基因保守片段设计用于检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的引物和探针，其序列如下:ISKNV -F:5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’ (SEQ ID NO:1);ISKNV - R:5’-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ (SEQ ID NO:2);ISKNV-P:5’-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT- Eclipse-3’ (SEQ ID NO:3); 荧光探针报告基团为FAM，淬灭基团为Eclipse。2、阳性标准品的制备 提取鳜鱼传染性脾肾 坏死病毒0RF007蛋白核酸序列，利用常规方法将其接入T载体中，即为阳性标准品。3、病毒DNA的提取 按照Qiagen血液组织DNA提取试剂盒(购自Qiagen公司，货号:69504)的说明书步骤，从感染相应病毒的鱼体内脏组织中提取DNA，作为荧光定量PCR反应的模板。4.荧光定量PCR扩增 每个测试反应体系为20yL，配制如下:待检测样品的DNA模板2yL、上、下游引物和突光探针各2 μ M, 2 X Tapman universal PCR Master Mix 10 μ L、无菌去离子水补足至15yL。同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括如下组分：针对鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的特异性引物及探针、荧光定量反应液、Tap酶。

【技术特征摘要】
1.一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括如下组分:针对鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的特异性引物及探针、荧光定量反应液、Tap酶。2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的特异性引物及探针是根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒0RF007基因保守区序列设计的。3.根据权利要求1或2所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的特异性引物及探针的序列如下所示:ISKNV-F: 5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’ (SEQ ID NO:1);ISKNV-R: 5’-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ (SEQ ID NO:2);ISKNV-P:5’-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT- Eclipse-3’ (SEQ ID NO:3)。4.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阳性标准品，所述阳性标准品为含有鳜传染性脾肾坏死病毒DNA的质粒。5.一组用于检测鳜传染性脾肾坏死病毒的荧光定量PCR特异性引物及探针，序列如下所述ISKNV -F: 5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：林强，付小哲，李宁求，吴淑勤，石存斌，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44