一种仿刺参体腔液病毒的快速定量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种仿刺参体腔液病毒的快速定量检测方法，包括以下步骤：1)仿刺参体腔液的提取；2)体腔液细胞超声波破碎，冻融，释放病毒粒子；3)体腔液过滤，制成含有病毒的氧化铝滤膜；4)避光染色、制片、观察、计数。本发明专利技术可以在不杀死仿刺参的情况下对仿刺参体内病毒进行快速直接检测，检测过程可以在5小时内完成，具有操作简单、快捷、准确的特点，可用于仿刺参苗种繁育的种参快速筛选。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，包括以下步骤：1)仿刺参体腔液的提取；2)体腔液细胞超声波破碎，冻融，释放病毒粒子；3)体腔液过滤，制成含有病毒的氧化铝滤膜；4)避光染色、制片、观察、计数。本专利技术可以在不杀死仿刺参的情况下对仿刺参体内病毒进行快速直接检测，检测过程可以在5小时内完成，具有操作简单、快捷、准确的特点，可用于仿刺参苗种繁育的种参快速筛选。【专利说明】
本专利技术属水产品质量检测
，具体涉及。
技术介绍
我国的仿刺参(Apostichopus japonicus)增养殖区主要集中在山东半岛和辽东半岛周边沿海地区，养殖面积超过百万亩，年产值超过百亿元，是继对虾、扇贝、海水鱼养殖之后兴起的又一新的支柱产业。然而养殖的过速发展和不规范运作，加之配套的科学研究、基础设施、养殖工艺和技术的滞后，导致了仿刺参种质下降、病害频发、严重阻碍了该产业的稳定、健康和可持续发展。近年来，我国沿海地区仿刺参养殖过程中新发现仿刺参体内存在大量病毒，造成仿刺参自身免疫力下降，从而使仿刺参在苗种繁育和养殖过程中出现病害频发现象。自2004年以来，国内外学者通过电镜负染技术观察到患病仿刺参体内各组织中均存在着大量球状病毒，该病毒没有固定的靶器官(包括体壁、肠道、呼吸树、性腺等组织)。邓欢等(2006 ；2008)分别于2004至2006年期间从辽宁沿海的患病参体内观察到一种新的球状病毒，对发病幼体及亲参性腺、体壁、肠管和呼吸树上清液通过电镜负染观察皆可见大量病毒颗粒存在。王品虹等(2005)利用电镜负染技术检测发病的养殖刺参组织提取液，观察发现提取液中存在大量病毒样粒子，应用超薄切片技术发现该种病毒颗粒大量存在于刺参的触手顶部、触手臂、疣足、呼吸树、背长血管、肠等组织内。宋坚等(2007)利用电镜负染技术对2006年夏季大连地区养殖场患脱板病的仿刺参稚参组织匀浆液进行了检测，发现提取液中存在大量病毒样粒子，该病毒粒子近似球形，具有囊膜。优质苗种是养殖生产的关键，现有的仿刺参种参质量只能通过个体外观来判断，而在不杀死种参的前提下进行体内病毒检测，可以防止携带病毒的种参进入苗种繁育过程，从而控制苗种质量，避免病毒的垂直传播，为优质苗种的生产提供保证。现阶段国内外还缺乏仿刺参体内病毒种类的相关报道，这也给根据种类进行病毒定量检测带来很大困难。另外，传统的电镜负染技术和超薄切片技术检测仿刺参体内病毒的方法具有操作复杂、时间漫长、费用高昂、可行性低等缺点，无法适应仿刺参养殖生产的需要。因此，迫切需要发展一种有效的仿刺参体内病毒快速检测方法。
技术实现思路
针对现有的控制技术和方法存在的问题，本专利技术的目的在于提供。，该方法包括:(I)将无菌注射器针头从刺参排泄孔上方腹部1.5~2cm处刺入腹腔，进入腹腔0.5~Icm后定量抽取体腔液1.5~2mL ；(2)将体腔液采用冻融处理，再进行超声破碎；(3)将体腔液用孔径为0.02 μ m的氧化铝滤膜过滤，在负压(15~20kPa)条件下把样品抽滤至干；(4)在冰浴条件下，用浓度为0.1%~0.5%的核酸荧光染色剂工作液将(3)中经抽滤的氧化铝滤膜避光染色10~15min ;干燥后制片，在荧光显微镜蓝色激发光道、油镜下观察病毒颗粒，计算病毒颗粒数。所述冻融处理是将体腔液放置-80°C冰箱中采用慢冻缓融的方法。所述冻融次数为3~4次。所述超声破碎次数为3~4次。所述超声破碎是90秒/次，每次间隔5min，所述间隔期间是在冰浴条件下降温。所述过滤使用的滤器衬垫直径为13mm或25mm或47mm。所述过滤还包括在所述氧化铝滤膜上方放置孔径0.45 μ m的微孔滤膜。所述核酸突光染色剂为SYBR Green I或Gene Finder或Gel Green。本专利技术具有操作简单、快捷、准确的特点，在不杀死仿刺参的情况下对仿刺参体腔液病毒进行直接检测，检测过程可在5小时内完成，解决了仿刺参养殖技术中存在的关键问题，可用于仿刺参苗种繁育的种参快速筛选。【专利附图】【附图说明】图是仿刺参体腔液病毒荧光图片【具体实施方式】以下通过实施例对本专利技术进行详细说明，该实施例仅用于说明本专利技术而非对本专利技术的限制。实施例1:对辽宁省海洋水产科学研究院引育种中心仿刺参苗种繁育的种参进行体腔液病毒检测，随机抽取种参，共50只仿刺参，从4只仿刺参体腔液中检测出病毒。以检测仿刺参种参样品a为例，具体方法如下:1、体腔液提取待检测仿刺参a样品体长约20em，将待检测的仿刺参平放在洁净的滤纸上，并用滤纸吸干仿刺参腹部表面的海水，随后让刺参腹部朝上，用2mL无菌注射器的针头缓慢从刺参排泄孔上方2cm处轻轻刺入腹腔，进入腹腔Icm后，缓慢抽取2mL体腔液，然后缓慢拔出针头并将仿刺参放回预先备好的容器中。2、释放病毒粒子将抽取的体腔液立即装于5mL冻存管中，先放置_80°C冰箱中采用慢冻缓融方法反复冻融4次。将冻融后的体腔液经超声波细胞破碎仪冰浴条件下连续破碎3次(90秒/次，输出功率200W，每次间隔5min冰浴降温)。将细胞破碎液于4°C、3000rpm下高速冷冻离心30min后，收集上清液。此方法的细胞破碎率可达到99%以上，使病毒粒子充分释放出来。每次超声波粉碎后的细胞破碎情况和细胞碎片大小可通过光学显微镜进行观察，细胞破碎率用下列公式进行计算【权利要求】1.，该方法包括: (1)将无菌注射器针头从刺参排泄孔上方腹部1.5~2cm处刺入腹腔，进入腹腔0.5~Icm后定量抽取体腔液1.5~2mL ； (2)将体腔液采用冻融处理，再进行超声破碎； (3)将体腔液用孔径为0.02 μ m的氧化铝滤膜过滤，在负压(15~20kPa)条件下把样品抽滤至干； (4)在冰浴条件下，用浓度为0.1%~0.5%的核酸荧光染色剂工作液将(3)中经抽滤的氧化铝滤膜避光染色10~15min ;干燥后制片，在荧光显微镜蓝色激发光道、油镜下观察病毒颗粒，计算病毒颗粒数。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是所述冻融处理是将体腔液放置-80°C冰箱中采用慢冻缓融的方法。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征是所述冻融次数为3~4次。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是所述超声破碎次数为3~4次。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是所述超声破碎是90秒/次，每次间隔5min,所述间隔期间是在冰浴条件下降温。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是所述过滤使用的滤器衬垫直径为13_或25mm 或 47mm。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是所述过滤还包括在所述氧化铝滤膜上方放置孔径为0.45 μ m的微孔滤膜。8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是所述核酸荧光染色剂为SYBRGreen I或Gene Finder 或 GelGreen0【文档编号】C12R1/93GK103966357SQ201310034673【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月24日 优先权日:2013年1月24日 【专利技术者】姜北, 周遵春, 关晓燕, 董颖, 杨爱馥, 王摆, 陈仲, 高杉, 蒋经伟 申请人:辽宁省海洋水产科学研究院本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种仿刺参体腔液病毒的快速定量检测方法，该方法包括：(1)将无菌注射器针头从刺参排泄孔上方腹部1.5～2cm处刺入腹腔，进入腹腔0.5～1cm后定量抽取体腔液1.5～2mL；(2)将体腔液采用冻融处理，再进行超声破碎；(3)将体腔液用孔径为0.02μm的氧化铝滤膜过滤，在负压(15～20kPa)条件下把样品抽滤至干；(4)在冰浴条件下，用浓度为0.1％～0.5％的核酸荧光染色剂工作液将(3)中经抽滤的氧化铝滤膜避光染色10～15min；干燥后制片，在荧光显微镜蓝色激发光道、油镜下观察病毒颗粒，计算病毒颗粒数。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姜北，周遵春，关晓燕，董颖，杨爱馥，王摆，陈仲，高杉，蒋经伟，
申请(专利权)人：辽宁省海洋水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21