基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr的装置及其制备方法制造方法及图纸

一种基于上转换发光技术(UPT)的联合定量检测疾病标志物尿中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(uNGAL)和尿液稀释影响纠正因子尿肌酐(uCr)的免疫层析装置及其制备方法，属于免疫检测技术领域。由样品稀释液冻干粉、NGAL和Cr标准品冻干粉、免疫层析试纸条组成；免疫层析试纸条由衬板、样品垫或UCP结合垫、分析膜及吸收垫组成；分析膜上设有平行的两个检测线T1、T2和一个质控线C，两个检测线T1、T2分别包被抗NGAL抗体和抗Cr抗体，质控线包被抗UCP标记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体，所述试纸条可使用UCP读数仪定量uNGAL和uCr。本发明专利技术可联合定量不同分子形式uNGAL和uCr，具有快速、简便等优点。uNGAL经uCr纠正后可提高NGAL早期诊断肾损伤等疾病的能力，因此具有极大的科研和临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫学检测
，具体涉及基于上转换发光技术(UPT)的联合定量检测疾病生物标志物尿中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(uNGAL)和尿液稀释影响纠正因子尿肌酐(uCr)的免疫层析装置及其制备方法。
技术介绍
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)又称人中性粒细胞脂质运载蛋白(human neutrophil lipocalin，HNL)是90年代初在中性粒细胞第二颗粒中发现的一种糖蛋白，属脂质运载蛋白(lipocalin)超家族成员，和其他脂质运载蛋白具有相似空间结构(J.Biol.Chem.1993，268:10425-10432；Scand.J.Clin.Lab.Invest.1994，54:365-376)。NGAL以单体、同二聚体及与MMP9形成异二聚体等多种分子形式存在，不同分子形式NGAL与不同的病理过程具有差异相关性。其中单体NGAL与肾小管急性损伤有相对较高的相关性，而同二聚体NGAL能有效反映尿道感染和细菌感染情况。除中性粒细胞能分泌NGAL外，在生理条件下NGAL在人多种组织有表达但表达水平低；在病理条件下如炎症、感染、肿瘤、缺血等，NGAL可在多种组织中上调表达(Histochem.J.1999，31:433-441；Mol.Med.Rep.2012，6:716-722)。近20多年来，NGAL作为急性细菌感染、肿瘤、肾功能损伤等疾病的标志物受到人们的关注。特别是NGAL作为肾功能损伤的早期诊断生物标志物越来越受到人们重视。目前有血清、血浆及尿NGAL用于肾功能损伤的早期诊断的报道。与临床现在采用的血清肌酐(sCr)相比，NGAL在早期诊断肾功能损伤时表现出优异性能。已报道NGAL在早期诊断因缺血(J.Endourol.2013，27:1510-1515)、抗肿瘤药物顺铂(Am.J.Nephrol.2004，24:307-315)、脓毒症(Biomed.Res.Int.2015，2009，186:48-51；中国实用医药2015，24:46-47)、心脏外科手术(Lancet 2005，365:1231-1238；Clin.Chim.Acta.2009，403:121-125)等引起的急性肾功能损伤(AKI)时，比sCr提前1到2天预判患者是否将发生AKI，这为临床介入治疗AKI争取到了宝贵时间。与血清和血浆NGAL相比，尿NGAL(uNGAL)用作诊断AKI的生物标志物尤其吸引人们的注意力，主要原因有以下三点：第一，动物模型和体外细胞培养研究结
果表明急性肾损伤时肾小管上皮细胞上调表达NGAL而尿液又直接与病变部位接触，因此uNGAL能直接迅速反映肾损伤情况；第二，尿液取样方式为非侵袭性，容易得到患者的配合，是最容易获得的体液样本；第三，目前尿液检查是判断肾脏疾病的一种最常见的必须的检查项目。另一方面，虽然uNGAL作为肾功能生物标志物有其自身独特的优点，但是尿液中NGAL的浓度受患者饮水、静脉点滴注射药物等因素导致的尿液稀释影响，从而不能十分有效的反映真实的尿NGAL浓度的动态变化情况，因此需要对因尿液稀释而导致的影响进行纠正。目前在临床上，uCr水平用于纠正尿液稀释对尿中检测物浓度带来的影响由来已久。肌酐(Cr)是肌肉里磷酸肌酐的代谢产物，机体通常以恒定的速率产生；此外，肌酐是小分子物质，可自由通过肾小球滤过且在肾小管内很少或不被重吸收。因此，机体每日产生的肌酐几乎全部随尿排出，uCr的日排出量很稳定，基本不受食物蛋白质含量和尿量的影响。所以可以通过测定uCr水平来纠正尿液因稀释对uNGAL浓度动态变化的影响。目前实验室研究和临床应用虽然有单独分别测试NGAL和uCr的方法，但至今没有在同一样本同时联合检测这两种标志物的方法和装置的报道。而将来NGAL有可能成为AKI临床即时就地检验(Point of Care Testing，POCT)项目。因此，设计和开发uNGAL和uCr联合定量方法和装备具有巨大的实验室科学研究和将来临床应用需求。NGAL定量方法有RIA(国际专利WO/1995/029404A1和中国ZL 200980155194等)、ELISA(欧洲专利EP 2225268和中国专利ZL200980155194等)、Western-blotting、胶乳免疫比浊法(中国专利ZL 201410431182)、化学发光免疫分析法(中国专利申请号201510184818)等。以上各种NGAL定量方法有各自优点和用途，但也存在一些缺点。对NGAL检测需求来讲，最显著的缺点是检测周期长，很难满足用于POCT检测项目要求。免疫层析技术是一种快速诊断方法，常用于POCT项目。近年来发展的NGAL免疫层析技术(中国专利ZL201220323587、ZL201420423962、ZL201220392399、ZL201220323586和ZL201220497401)可以缩短检测时间。以上公开的NGAL免疫层析技术虽然具有操作方便和检测快速等优点，但各种报告分子自身固有的缺点限制了相关产品的性能。如荧光免疫层析因荧光染料易发生淬灭而导致产品稳定性差；荧光乳胶颗粒因其采用的荧光染料系物理掺杂而成，容易发生泄漏，另外该类材料易发生非特异性吸附从而导致信噪比低问题；免疫胶体金技术采用物理吸附的方法使标记物和报告分子结合，因物理吸附力弱标记物容易从报告分子金纳米颗粒表面脱落而影响检测性能。近年来，以稀土金属元素掺杂于晶体的晶格中而构成的上转换发光材料
(up-converting phosphor，UCP)为报告分子的免疫层析上转换发光技术(up-convertingphosphor technology，UPT)是目前临床POCT检测领域的一个研究开发重点和热点。UCP由主基质(host matrix)、吸收子(absorber)和发射子(emitter)三部分组成，具有上转发光现象即在红外光激发下发射可见光。UCP产生的信号可以由UCP读数仪读取。由于该种材料为人工合成且在自然界和体内并没有类似物质存在，因此无背景干扰问题；此外，UCP还具有稳定性好、无焠灭、环境友好和生物相容性好等优异性能，该材料作为示踪剂已应用于多种POCT检测系统中。中国专利(ZL201220497401)公开了一种NGAL检测的上转发光快速定量装置，该技术部分克服了目前NGAL检测技术的不足，但是该技术并没有考虑因尿液稀释而影响NGAL定量从而影响NGAL诊断肾功能损伤能力这一事实；此外该公开的技术并没有考虑不同分子形式NGAL在诊断疾病时临床表现的差异。因此ZL201220497401只是一种测定NGAL浓度的方法，并不能确定其测定的uNGAL是否真实反映uNGAL动态变化情况和不能区分测定不同分子形式的NGAL，从而限制了uNGAL作为肾功能损伤标志物的能力进而限制了该方法未来的临床应用。uCr定量方法主要有基于肌酐脱亚胺酶和肌酐酶的酶法、基于肌酐与苦味酸盐作用生成黄红色的苦味酸肌酐复合物的化学测定法(Jaffe法)和基于肌酐在弱酸性环境中带正电荷可通过阳离子交换层本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，其特征在于：由样品稀释液冻干粉、NGAL和Cr标准品冻干粉、免疫层析试纸条组成；(1)样品稀释液冻干粉是将20mL、pH＝7.2～7.5，含150～250mmol/L NaCl、0.25～0.5％(vol/vol)Tween‑20、0.5％～2％(wt/vol)BSA或2.5％～5％(wt/vol)脱脂奶粉的50～100mmol/L HEPES缓冲液经机械或磁力搅拌充分后，采用0.22μm或0.45μm滤器进行过滤除菌和除去不溶性杂质，经冻干后得到；(2)NGAL和Cr标准品冻干粉共4套，其中，标准品A：是用于单体uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng单体NGAL和6μmol Cr；标准品B：用于同二聚体uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng同二聚体NGAL和6μmol Cr；标准品C：用于异二聚uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng异二聚体NGAL和6μmolCr；标准品D：用于三种分子形式uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng NGAL和6μmol Cr，其中单体NGAL、同二聚体NGAL及异二聚体NGAL各占40％、40％和20％；(3)所述免疫层析试纸条分A和B两类，A类免疫层析试纸条由衬板、样品垫、分析膜及吸收垫组成；B类免疫层析试纸条由衬板、UCP结合垫、分析膜及吸收垫组成；UCP结合垫中含有UCP标记抗NGAL抗体和UCP标记Cr；(4)分析膜上设有平行的两个检测线T1、T2和一个质控线C，两个检测线T1、T2分别包被抗NGAL抗体和抗Cr抗体，且两者可以相互对调；质控线包被抗UCP标记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体；所述衬板用于支撑样品垫或UCP结合垫、分析膜和吸收垫的组装，所述UCP结合垫用于结合UCP标记抗NGAL体和UCP标记Cr，所述分析膜用于检测线和质控线的设置从而实现NGAL和Cr的定量及免疫层析试纸条的质控，所述吸收垫用于收集分析后的样品溶液。...

【技术特征摘要】
1.一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，其特征在于：由样品稀释液冻干粉、NGAL和Cr标准品冻干粉、免疫层析试纸条组成；(1)样品稀释液冻干粉是将20mL、pH＝7.2～7.5，含150～250mmol/L NaCl、0.25～0.5％(vol/vol)Tween-20、0.5％～2％(wt/vol)BSA或2.5％～5％(wt/vol)脱脂奶粉的50～100mmol/L HEPES缓冲液经机械或磁力搅拌充分后，采用0.22μm或0.45μm滤器进行过滤除菌和除去不溶性杂质，经冻干后得到；(2)NGAL和Cr标准品冻干粉共4套，其中，标准品A：是用于单体uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng单体NGAL和6μmol Cr；标准品B：用于同二聚体uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng同二聚体NGAL和6μmol Cr；标准品C：用于异二聚uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng异二聚体NGAL和6μmolCr；标准品D：用于三种分子形式uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng NGAL和6μmol Cr，其中单体NGAL、同二聚体NGAL及异二聚体NGAL各占40％、40％和20％；(3)所述免疫层析试纸条分A和B两类，A类免疫层析试纸条由衬板、样品垫、分析膜及吸收垫组成；B类免疫层析试纸条由衬板、UCP结合垫、分析膜及吸收垫组成；UCP结合垫中含有UCP标记抗NGAL抗体和UCP标记Cr；(4)分析膜上设有平行的两个检测线T1、T2和一个质控线C，两个检测线T1、T2分别包被抗NGAL抗体和抗Cr抗体，且两者可以相互对调；质控线包被抗UCP标记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体；所述衬板用于支撑样品垫或UCP结合垫、分析膜和吸收垫的组装，所述UCP结合垫用于结合UCP标记抗NGAL体和UCP标记Cr，所述分析膜用于检测线和质控线的设置从而实现NGAL和Cr的定量及免疫层析试纸条的质控，所述吸收垫用于收集分析后的样品溶液。2.如权利要求1所述的一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，其特征在于：A、B两类免疫层析试纸条的样品垫或UCP结合垫、分析膜、吸收垫及衬板的宽度一致，均为4～5.5mm，样品垫和UCP结合垫的长度为5～10mm，分析膜的长度为25～40mm，吸收垫的长度为20～30mm，衬板的长度等于前后搭接组装后样品垫或UCP结合垫、分析膜及吸收垫的长度总和。3.如权利要求1所述的一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，其特征在于：其中样品垫和UCP结合垫的材料为玻璃纤维素膜或具有类似性质的膜材料，分析膜的材料为硝酸纤维素膜或具有类似性质的膜材料，吸收垫的材料为吸水滤纸或具有类似功能的材料，衬板的材料为具有自粘贴性质聚氯乙烯胶板或具有类似功能的材料。4.如权利要求1所述的一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，其特征在于：A类免疫层析试纸条的使用是将标准品工作液用样品稀释液进行2倍梯度稀释法进行稀释，获得标准品浓度梯度溶液；将尿液样品用样品稀释液稀释10～100倍；取25～100μL上述标准品浓度梯度溶液或尿液样品稀释液分别复孔加入相应的96孔板的孔中或类似结构的容器当中，然后在上述96孔板中再各加入25～100μL经稀释的UCP标记抗NGAL抗体溶液和UCP标记Cr溶液组成的混合溶液，混匀制成悬液；接着将A类免疫层析试纸条的样品垫端垂直浸入上述悬液中，等待5～30min后取出水平放置5～20min后进行UCP信号采集。5.如权利要求1所述的一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，其特征在于：B类免疫层析试纸条的使用是将标准品工...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡林君，陈雷，杨津，赵冰，姜春来，孔维，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22