本发明专利技术公开了一种基于上转换荧光能量共振转移(UC‑LRET)技术并结合不同的杂交(hybridization)、连接(ligation)双识别过程，从而实现对microRNA单步、均相、高灵敏检测。主要应用于microRNA表达谱分析、microRNA临床诊断、microRNA研究检测及microRNA相关药物研究及筛选。本发明专利技术具有以下优点：(1)操作步骤少，属于“一步法”检测。(2)稳定性好，可以长时间保存，检测性能不下降。(3)由于在近红外区(980nm)激发，避免了背景荧光的产生。因此，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术及临床医学诊断领域，涉及一种双识别检测microRNA的定量检测方法。基于上转换荧光能量共振转移(UC-LRET)技术并结合不同的杂交(hybridization)、连接(ligation)双识别检测，从而实现对microRNA单步、均相、高灵敏检测。主要应用于microRNA表达谱分析、microRNA临床诊断、microRNA研究检测及microRNA相关药物研究及筛选。
技术介绍
microRNA(下文简称“miRNA”)是一类长度约为20-24个核苷酸(nt)的非编码RNA，它能调控超过一半的人类基因。[参见(a)D.P.Bartel，Cell，2009，136，215-233.(b)S.L.Ameres，M.D.Horwich，J.H.Hung，J.Xu，M.Ghildiyal，Z.WengandP.D.Zamore，Science，2010，328，1534-1539.(c)Y.Chen，D.Y.GaoandL.Huang，Adv.DrugDeliveryRev.2015，81，128.(d)R.Devulapally，N.M.Sekar，T.V.Sekar，K.Foygel，T.F.Massoud，J.R.K.WillmannandR.Paulmurugan，ACSNano，2015，9，2290.]相同的miRNA在不同的组织、器官和不同的细胞之间具有相似的调控功能，具有保守性。但不同组织器官、不同细胞以及细胞发育的不同阶段，其miRNA的表达谱并不相同，这一细胞及“时空”特异性使其可以作为某些组织器官、不同细胞以及细胞发育不同阶段的特异性分子标志。近年来，miRNA更是被认为是诊断及治疗某些疾病的新一代标志物及标靶。[参见(a)R.Ma，T.JiangandX.Kang，J.Exp.Clin.CancerRes.2012，31，38.(b)Y.Cao，R.A.DePinho，M.ErnstandK.Vousden，Nat.Rev.Cancer，2011，11，749.]miRNA已经成为近年来的研究热点，然而，由于miRNA具有的非常低浓度、易于降解、短链长度(18-24nt)以及很强的序列相似性这些特征使得灵敏、特异性检测miRNA变得非常困难。目前，微阵列芯片“杂交”(hybridization)及基于定量实时聚合酶链反应(PCR)技术是两种定量检测miRNA的最常见技术。[参见A.Git，H.Dvinge，M.Salmon-Divon，M.Osborne，C.Kutter，J.Hadfield，P.BertoneandC.Caldas，RNA，2010，16，991.]。然而，由序列多样性造成的miRNA熔点温度差异性使得hybridization为基础的技术很难应用于大规模的表达分析，而PCR为基础的技术又需要miRNA标记及互补DNA转化步骤等多个程序，使得检测miRNA耗时、耗力。[参见(a)Z.Gao，H.Deng，W.ShenandY.Ren，Anal.Chem.2013，85，1624-1630.(b)Y.Ren，H.Deng，W.ShenandZ.Gao，Anal.Chem.2013，85，4784-4789.]因此，发展快速、简单和灵敏的生物检测miRNA技术在生物研究和临床诊断上具有重要意义。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于上转换荧光能量共振转移(UC-LRET)技术的高灵敏检测miRNA的方法，它能够提供在生物环境下“无背景”均相检测，而且通过不同的杂交“hybridization”及融合“ligationsteps”双识别步骤使得检测的专属性大大提高。本专利技术是由信号产生单元和识别单元组成，上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸作为荧光的供体，而染料Cy3偶联的寡核苷酸作为荧光的接受体，供体-接受体共同组成了一对上转换荧光能量共振转移寡核苷酸对，作为信号产生单元；识别单元包括两段对目标miRNA具有特异性识别的序列。在近红外光激发下(980nm)，产生上转换荧光共振能量转移信号，能够实现对miRNA的高灵敏度、高选择性检测。采用的技术方案：一种用于定量检测miRNA的上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸(LRET-B)，其中所述的寡核苷酸序列从5’端开始为与识别单元互补配对的特异性序列、控制寡核苷酸长度的序列及3’端修饰C7氨基序列组成。一种用于定量检测miRNA的染料分子Cy3标记的寡核苷酸(LRET-A)，其中所述的寡核苷酸序列从5’端开始标记有Cy3控制寡核苷酸长度的序列、与识别单元互补配对的特异性序列及3’端C6修饰。一种用于定量检测miRNA的识别单元寡核苷酸(RD-REG-D)，其中所述的寡核苷酸序列从PO4修饰的5’端开始与目标miRNA互补配对的特异性序列、与寡核苷酸(LRET-B)互补配对的特异性序列及3’端组成。一种用于定量检测miRNA的识别单元寡核苷酸(RA-REG-A)，其中所述的寡核苷酸序列从5’端开始与寡核苷酸(LRET-A)互补配对的特异性序列、与目标miRNA互补配对的特异性序列及修饰有-OH基团的3’端组成。一种基于上转换荧光能量共振转移(UC-LRET)技术的高灵敏检测miRNA的方法，按以下步骤进行：(1)、上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记寡核苷酸(LRET-B)：1～3ml浓度为0.2～2mg/ml羧基化的上转换纳米颗粒UCNPs溶液中添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)2～6mg及1～4mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下振荡60分钟，然后将50～150μL的0.5～2μM的寡核苷酸(LRET-B)溶液加入上述溶液中，在室温下反应12～24小时。反应完毕后，超滤离心，产物保存在含有0.1％牛血清蛋白BSA缓冲液中(pH7.4)。(2)、基于双识别microRNA的定量检测：5～15nM上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸(LRET-B)、5～15nM染料分子Cy3标记的寡核苷酸(LRET-A)、5～15nM两种双识别单元寡核苷酸(RA-REG-A)、(RD-REG-D)、0.02～0.12CEURNA连接酶以及一定浓度的目标miRNA混合在100μLmiRNA缓冲液中，miRNA缓冲液组成为(25mMHEPES缓冲液，0.4mMATP，50mMNaCl，2mMMgCl2，100μg/mlsinglestrandedsalmonspermDNA，pH7.4+0.1％BSA)。混合样品在20～40℃孵育60～120min，最后进行上转换荧光定量分析。激发光用980nm的激光光源激发，功率在0～3W间进行调节。与现有的“微阵列杂交法”及“定量PCR扩增法”相比，本专利技术所提供的基于上转换荧光能量共振转移(UC-LRET)技术的高灵敏检测miRNA的方法具有以下优点：(1)操作步骤少，属于“一步法”检测。而“微阵列杂交法”及“定量PCR扩增法”需要杂交反应、扩增及其染色及染色，分析步骤多，在此过程中容易出错。(2)稳定性好，可以长时本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双识别检测microRNA的定量检测方法，其特征在于按以下步骤进行：(1)、上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记寡核苷酸(LRET‑B)：1～3ml浓度为0.2～2mg/ml羧基化的上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)溶液中添加1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)2～6mg及1～4mg的N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下振荡60分钟，然后将50～150μL的0.5～2μM的寡核苷酸(LRET‑B)溶液加入上述溶液中，在室温下反应12～24小时。反应完毕后，超滤离心，产物保存在含有0.1％牛血清蛋白BSA缓冲液中(pH7.4)。(2)、基于双识别microRNA的定量检测：5～15nM上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸(LRET‑B)、5～15nM染料分子Cy3标记的寡核苷酸(LRET‑A)、5～15nM两种双识别单元寡核苷酸(RA‑REG‑A)、(RD‑REG‑D)、0.02～0.12CEU RNA连接酶以及一定浓度的目标miRNA混合在100μL miRNA缓冲液中，miRNA缓冲液组成为(25mM HEPES缓冲液，0.4mM ATP，50mM NaCl，2mM MgCl2，100μg/ml single stranded salmon sperm DNA，pH7.4+0.1％BSA)。混合样品在20～40℃孵育60～120min，最后进行上转换荧光定量分析。...
【技术特征摘要】
1.一种双识别检测microRNA的定量检测方法，其特征在于按以下步骤进行：(1)、上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记寡核苷酸(LRET-B)：1～3ml浓度为0.2～2mg/ml羧基化的上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)溶液中添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)2～6mg及1～4mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下振荡60分钟，然后将50～150μL的0.5～2μM的寡核苷酸(LRET-B)溶液加入上述溶液中，在室温下反应12～24小时。反应完毕后，超滤离心，产物保存在含有0.1％牛血清蛋白BSA缓冲液中(pH7.4)。(2)、基于双识别microRNA的定量检测：5～15nM上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸(LRET-B)、5～15nM染料分子Cy3标记的寡核苷酸(LRET-A)、5～15nM两种双识别单元寡核苷酸(RA-REG-A)、(RD-REG-D)、0.02～0.12CEURNA连接酶以及一定浓度的目标miRNA混合在100μLmiRNA缓冲液中，miRNA缓冲液组成为(25mMHEPES缓冲液，0.4mMATP，50mMNaCl，2mMMgCl2，100μg/mlsinglestrandedsalmonspermDNA，pH7.4+0.1％BSA)。混合样品在20～40℃孵育60～120min，最后进行上转换荧光定量分析。2.根据权利要求1所述的一种双识别检测microRNA的定量检测方法，其特征在于：(1)与上转换纳米颗粒(NaYF4：Er3+，Yb3+)标记的寡核苷酸(LRET-B)，其序列为5’-TTGTGT...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱栋，胡玥，张小静，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。