本发明专利技术提供了人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒包括RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、引物探针、阴性对照、强阳性对照、弱阳性对照、校准品1号~5号。本发明专利技术可对提取好的HIV-1RNA直接进行一步法荧光定量RT-PCR反应，检测样本中HIV-1RNA的病毒载量，并依靠内参基因作为内对照、利用UNG酶预防污染。本发明专利技术的试剂盒一步法扩增方法简单、程序简短、操作简便、预防污染，检测结果特异性强、敏感度高、结果明晰、可信度高，可用于血清中人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）RNA病毒载量检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒包括RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、引物探针、阴性对照、强阳性对照、弱阳性对照、校准品1号~5号。本专利技术可对提取好的HIV-1RNA直接进行一步法荧光定量RT-PCR反应，检测样本中HIV-1RNA的病毒载量，并依靠内参基因作为内对照、利用UNG酶预防污染。本专利技术的试剂盒一步法扩增方法简单、程序简短、操作简便、预防污染，检测结果特异性强、敏感度高、结果明晰、可信度高，可用于血清中人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）RNA病毒载量检测。【专利说明】人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量PCR检测试剂盒
本专利技术属生物
，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1) RNA荧光定量检测试剂盒。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(Lentivirus),属反转录病毒(Retrovirus)的一种。该病毒破坏人体的免疫功能，导致免疫系统的失去抵抗力，从而导致各种疾病病原体得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病(即获得性免疫缺陷综合征，Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)，为一种至今无有效疗法的致命性传染病。自1981年在美国首次发现和确认以来，艾滋病已夺取超过3000万人的性命，使它成为史上最具破坏力的全球性流行病之一，截至2011年5月底世界上约有6400万人感染艾滋病毒，每天平均有7000宗新病例。目前，南亚和东南亚成为继撒哈拉以南非洲之后的第二重灾区。中国CDC估计，截止至2011年底，我国存活HIV携带者及艾滋病患者约78万人，全年新发感染者4.8万人，死亡2.8万人。疫情已覆盖全国所有省、自治区、直辖市，目前我国面临艾滋病发病和死亡的高峰期，且已由吸毒、暗娼等高危人 群开始向一般人群扩散，防艾、抗艾形势严峻。HIV感染后病毒载量的变化与疾病的进程有密切的相关性，HIV病毒载量的检测可以预测疾病发生、发展以及预后，因此，HIV病毒载量的检测可以监控疾病的发展过程，并为制定相应的治疗方案和策略提供依据；而且病毒载量较高的孕妇造成母婴传播的危险性较大，可根据病毒载量确定孕妇是否需服用抗病毒药物来减少HIV的母婴传播。抗HIV病毒药物的作用主要是抑制病毒的复制，降低病毒载量。因此，病毒载量的检测对疾病的监控、预防母婴传播以及观察抗病毒药物的疗效都具有重要的意义。根据基因差异，可将HIV分为HIV-1型和HIV-2型。一般，HIV-1病毒是绝大多数HIV感染的病原体，HIV-2病毒主要出现在非洲，尤其是在西非地区。HIV-2的传播方式与HIV-1相同，都会发生机会性感染和AIDS，但HIV-2所致的免疫缺陷发展得较为缓慢和温和。不同地区流行的亚型不同，同一亚型在不同地区的流行态势也存在一定差异。目前，世界范围内流行的主要为HIV-1型。在美国，因为HIV-2较为少见，所以HIV-2未被列为常规检测。中国境内流行的HIV主要为M组HIV-1型(目前境内尚未见HIV-1 N组和O组的报道，HIV-2型感染病例的报道极少)，其基因型主要为B/B’、BC重组型(包括CRF 07_BC重组型和CRF 08_BC重组型)以及AE重组型(CRF 01_AE重组型)。而且，HIV-1基因型具有一定的地域差异，不同的地区流行的HIV基因型也不尽相同，如CRF 07_BC重组型流行于四川、新疆等地，而CRF 08_BC重组型则流行于广西等地。目前，HIV的检测方总体可分为抗体检测和病毒检测两大类。病毒检测包括细胞培养(病毒分离)、P24抗原检测和病毒核酸检测。早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体，间接地诊断HIV感染。近几年，分子生物学方法不断被应用到HIV的检测中，HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了 HIV实验室诊断的发展方向。传统的核酸检测方法是采用核酸杂交技术对目的核酸进行检测，虽然采用放射性标记的探针可以提高检测的敏感性，但仍然偏低，不能满足临床需要。最近几年核酸检测技术发展迅速，主要是采用各种扩增放大技术提高检测的灵敏度。随着扩增技术的成熟，可以将低拷贝的靶序列成对数级放大扩增，同时采用比放射性探针更灵敏的非放射性检测系统(如电化学发光系统等)，明显提高核酸检测的灵敏度，并减少放射性物质的污染。检测HIV-1 RNA病毒载量的方法主要有分支DNA检测(bDNA)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和核酸序列扩增检测(NASBA)等，其中，基于TaqMan探针技术的荧光定量RT-PCR方法已发展成为成熟、常用而有效的检测手段。TaqMan探针技术是高度特异的荧光定量PCR技术。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’ -末端，淬灭基团在探针3’ -末端。当探针完整或与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’-端的淬灭基团接近而被淬灭，无荧光信号产生。在进行PCR反应延伸过程时，DNA聚合酶的5’ 一3’外切核酸酶活性将探针降解，使得荧光基团与淬灭基团分离，即产生荧光信号。每经历一个PCR反应循环，就有一分子的扩增产物生成，并伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团信号不断积累，为一个指数同步增长的过程，荧光信号的强度就代表了扩增产物的拷贝数。该技术具有特异性强、自动化程度高等特点、有效解决了 PCR污染等问题。HIV-1荧光定量检测正是基于这种原理设计，为HIV-1早期感染诊断、大规模筛查、疗效动态分析、新药开发等提供良好的技术支持。目前，国际上HIV-1病毒载量试剂主要有以下几种=COBASAmpliPrep / COBASTaqMan HIV-1 Test (Roche)、Abbott RealTime HIV-1 AmplificationKit (Abbott)>Versant HIV-1 RNA 3.0 (bDNA, Simens)、Roche Amplicor HIV-1 MonitorTest (Roche)、NucliSens HIV-1 QT (NASBA)和 NucliSens HIV-1 EasyQ (EasyQ)等。我国中山大学达安基因股份有限公司和凯杰生物工程(深圳)有限公司也研制出了 HIV-1核酸荧光定量诊断试剂，已获国家生产许可。同时为避免反应结果的假阴性，在反应体系中加入内参基因和内参探针。内参基因是含有与扩增基因中的探针序列不同慢病毒RNA序列，它带有与HIV-1扩增基因序列引物特异结合的区域。内参基因通过HIV-1扩增基因上下游特异性引物结合并能产生相同长度(137 bp)的扩增产物，其碱基组成与HIV-1扩增基因序列一致。同时利用UNG酶防污染的特性，在PCR扩增反应中用dUTP代替dTTP，这样仅在扩增片段中含有dUTP ;而dUTP使污染的扩增子在扩增靶DNA前易于被UNG酶降解:这种含有dUTP的PCR产物与UNG酶一起孵育，因UDG酶可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可从单链或本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：本专利技术通过考察人类免疫缺陷病毒1型基因组全序列，并对检索所得HIV‑1各个基因型一致性保守序列，根据该保守序列设计出一对HIV‑1特异性引物、一条HIV‑1特异性荧光探针和一条内参探针，采用实时荧光定量PCR方法扩增目的基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：迟大利，吴大治，夏懿，
申请(专利权)人：上海星耀医学科技发展有限公司，上海复星医药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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