一种三重荧光定量RT-PCR检测方法及其试剂盒，首先，检索到甲型流感病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒基因组全序列，并对检索所得的病毒各个亚型序列进行同源性比对，再针对每种病毒的保守序列设计出一对特异性引物和一条特异用荧光染料标记的探针，再采用实时荧光定量PCR方法扩增目的片段，以反应后发射的荧光的波段和强度，判断是哪种病毒感染。本发明专利技术具有下列优点：①检测时间周期短、检测效率高；②检测通量高，一次可检三种主要病原；③检测病毒特异性高，准确率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种甲型流感病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒三重荧光定量RT-PCR检测方法及其试剂盒，属于生物
技术介绍
甲流感病毒属于正粘病毒科的分节段单股负链RNA病毒，病毒形态为球型，直径 80-120nm。甲型流感病毒是呼吸道病毒性疾病的最主要病原，全球流感大流行均由甲型流 感病毒引起，其中最著名一次流感世界大流行发生于1918-1919年，全球只有澳大利亚未 被波及，当时世界人口的50%被感染，死亡人数至少有2000万，多于第一次世界大战死亡的 总人数。副流感病毒和呼吸道合胞病毒同属于副粘病毒科的不分节段单股负链RNA病毒， 副流感病毒和呼吸道合胞病毒形态也为球型，直径120-200nm。呼吸道合胞病毒是婴幼儿 下呼吸道的主要病原体，常常表现为毛细支气管炎和病毒性肺炎，也可引起较大儿童和成 人鼻炎和感冒等上呼吸道感染，呼吸道合胞病毒传染性强，主要流行期为冬季和早春。副流 感病毒是仅次于呼吸道合胞病毒的引起婴幼儿严重下呼吸道感染的重要病原体，在成人及 年长儿童中也会引起上呼吸道感染，副流感病毒主要通过气溶胶飞沫传播，传染性强，在冬 春季流行。针对甲型流感病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒建立快速高效的实验室检测技 术，对于疑似病人的及时诊断、治疗和防止抗生素滥用，以及卫生检疫部门和国家疾控部 门开展有效的传染病监控和流行病学调查研宄等都具有非常重要的意义。实时荧光定量 RT-PCR技术是一项快速、准确和特异的检测技术。实时荧光定量RT-PCR技术被证明能够胜 任临床呼吸系统病毒性感染的诊断，这种技术能代替传统的病毒培养和抗原检测等方法。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种甲型流感病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒三重荧 光定量RT-PCR检测方法及其试剂盒。本专利技术在按下述方法设计的引物和探针存在下，在荧光定量PCR仪中，对病毒核 酸进行PCR扩增，来实现对甲型流感病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒核酸的检测： 1、特异性的引物设计方法如下： 1) 同源性比对：从GeneBank数据库中调出甲型流感病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病 毒的基因序列； 2) 通过比对选取高度保守序列区域，在这保守区域内设计引物； 3) 以保守序列为基准设计一对特异性引物以及一条探针。2、引物设计原则： 1) 特异性引物的长度要求：每条引物长度为18~25个碱基，荧光探针长度为20~30个 喊基； 2) 特异性引物和荧光探针中GC%要求在40~60%，Tm最好接近72°C; 3)选用的引物和探针设计要求在每种病毒基因的保守区，只对这一种病毒具有特异， 和其它物种无交叉反应。 3、甲型流感病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒的特异性检测引物和探针分别 为： 1)甲型流感病毒检测上游引物： 5'-ACCAATCCTGTCACCTCTGAAAG-3' ； 甲型流感病毒检测下游引物： 5'-AAGCGTCTACGCTGCAGTCCGA-3' ； 甲型流感病毒检测探针： FAM-TTTGTGTTCACGCTCACCGTATTGGC-MGB ： 副流感病毒检测上游引物： 5'-ATTTCCAATCTTCAGGACTATGATC-3' ； 副流感病毒检测下游引物： 5'-CTCCTGGTATAGCAGTGACTGAACAT-3' ； 副流感病毒检测探针： JOE-ATTTACCTAAGTGATGGAATCAATCGCAAAGT-TAMRA ； 呼吸道合胞病毒检测上游引物： 5'-AATATGGAAACATACGTGAACATCC-3' ； 呼吸道合胞病毒检测下游引物： 5'-ACCCATATTGTWAGTGATGCAGA-3' ； 呼吸道合胞病毒检测探针： HEX-CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGC-BHQ1。 荧光探针5'端标记荧光报告基团HEX，3'端标记荧光淬灭基团BHQ1。 4、试剂盒的组成： 甲型流感病毒检测上游引物和下游引物混合物，甲型流感病毒检测探针，甲型流感病 毒阳性对照核酸；副流感病检测上游引物和下游引物混合物，副流感病毒检测探针，副流 感病毒阳性对照核酸；呼吸道合胞病毒检测上游引物和下游引物混合物，呼吸道合胞病 毒检测探针，呼吸道合胞病毒阳性对照核酸；RNase Free H20阴性对照、一步5XRT-PCR Buffer、Enzyme Mix〇 5、一步 5XRT-PCR Buffer 配制： Tris ? Cl 20mM KC1 80mM (NH4)2S04 80mM DTT 1. 5mM MgCl2 12mM dNTP lOmM 于-20°C保存。 6、Enzyme Mix 配制： Tris ? Cl 20mM KC1 80mM DTTImM EDTA 0.ImM NonidetP-40 0. 5% Tween20 0.5% 甘油 50% Taq酶 2.5U/ul M-MLV酶 2.5U/ul 于-20°C保存。 7、病毒核酸的提取： ①首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中 加入 30yg/mlcarrier RNA〇 ②取30y1蛋白酶放入1. 5ml离心管中。 ③将标本(如鼻/咽拭子、液化的痰液、胸水、灌洗液等)取200y1加入此管中，充 分混勾。 ④再在每管分别加入200y1漂洗液(含30yg/mlcarrierRNA)，混勾振荡30s， 70°C温育lOmin。 ⑤加入250y1无水乙醇，充分混勾振荡30s，室温裂解5min。 ⑥将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心lmin，弃收集管中的离心液。滤柱 仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液。 ⑦滤柱中加入500y1缓冲液1，12000rpm，离心lmin，弃收集管中的离心液。 ⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加 入500y1缓冲液2,12000rpm，离心lmin。重复步骤⑧一次。 ⑨将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37°C 15min以干燥滤膜。 ⑩将滤柱放在1. 5mlEppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-freeH20,室温 静置2min。12OOOrpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。 8、一步实时荧光定量PCR扩增(每份25ul体系） 取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul-步实时荧光定量PCR反应液至八联管中进 行荧光定量PCR扩增。a) -步实时荧光定量PCR反应液（mix)的配制： 一步荧光定量5 XPCRbuffer 4ul Enzyme Mix 5ul 三对特异性引物 各2ul 三条特异性荧光探针 各lul Rnase FreeH20 4ul 反应液体积： 20ul b) -步实时荧光定量PCR反应程序： ,1 50°C 30min 1 95 °C 5min S 94°C 15s 1' 60°C 30s :重'Goto3, 45个循环 c)检测： 本专利技术使用LightCycle480II荧光定量PCR仪，在FAM通道进行检测。d)结果判断： 在荧光定量PCR仪运转正常，阴性对照和阳性对照均正常的情本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种病毒三重荧光定量RT‑PCR检测方法，其特征在于：首先，检索到甲型流感病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒基因组全序列，并对检索所得的病毒各个亚型序列进行同源性比对，再针对每种病毒的保守序列设计出一对特异性引物和一条特异用荧光染料标记的探针，每条探针的荧光探针的发射光波段不重叠，防止这三种病毒检测结果之间的干扰，再采用实时荧光定量PCR方法扩增目的片段，以反应后发射的荧光的波段和强度，判断是哪种病毒感染。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘为勇，王涛，
申请(专利权)人：湖北创瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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