不存在小沟结合物的直接定量PCR制造技术

本文公开用于对存在于固体载体如滤纸上的核酸靶标进行定量的方法、组合物以及套组。这需要直接在滤纸上进行的定量实时聚合酶链反应(qrt PCR)，其中从荧光标记探针的结构中排除、进而从所述反应中排除了小沟结合物(MGB)。所述MGB的缺失将改善实时PCR中的背景荧光。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
核酸可以使用聚合酶链反应(PCR)通过检测PCR结束时的终点定量PCR或PCR期间的定量实时PCR(qrtPCR)所存在的扩增产物来进行定量。在qrtPCR中，在热循环期间，一般使用荧光染料来检测PCR产物。这允许在扩增指数期期间；在限量试剂或聚合酶灭活开始对PCR扩增效率起作用之前，基于荧光信号强度对模板进行定量。专门仪器用于qrtPCR检定。这些qrtPCR仪器用荧光计耦合PCR机器的热循环功能。热循环功能和荧光计的这一组合允许导管中实时分析。通过将反应管放置在qrtPCR仪器中并且使反应管经受热循环来进行qrtPCR。在各热循环回合期间，用光照明反应管并且通过荧光计收集从反应管发出的荧光。因为qrtPCR的准确性取决于荧光发射的测量，所以干扰或中断光学路径的因素减到最小。主要想法是qrtPCR反应管内的不透明材料将遮挡荧光信号，并且因此应被排除。为了解决这一点，一些群体现已报告qrtPCR检定，其中在qrtPCR期间滤纸存在于反应管中。明显地，这些群体中的每一个已报告滤纸的存在增加背景荧光。因此，在本专利技术之前，所属领域中需要一种简化qrtPCR检定，其中存在滤纸时观测到的背景荧光减轻。本专利技术解决这一问题和更多问题。
技术实现思路
DNA的量化在包括医学诊断和法医DNA分析的许多应用中起重要作用。通常，用于这些应用中的DNA来源于施加到滤纸上的血液或口腔样品。随后DNA的定量需要使用多种方法中的任一种从其来源和滤纸提取和去除DNA。这些方法包括洗涤、提取、苯酚/氯仿、二氧化硅膜、经二氧化硅涂布的珠粒、离子交换膜以及具有离子表面的磁珠。利用此类方法的问题包括DNA样品损失，并且其是费力的。去除提取和去除的必要性的工作流将是有利的。将滤纸沉积到qrtPCR中而不首先应用这些提取和去除方法是一种解决方案。但在qrtPCR期间包括滤纸影响基线荧光水平。因为这一点，很少尝试无提取和去除的DNA定量。先前未认识到但本文公开的是，背景荧光水平提高的原因是qrtPCR检定中小沟结合物(MGB)的存在。即，在存在MGB的直接定量检定与不具有MGB的相同检定之间的比较中，不具有MGB的检定将具有相对较低的背景荧光。因此，本文公开一种在未事先应用提取技术的情况下直接定量核酸的方法，所述方法包括将固体载体沉积到反应容器中，当固体载体在反应容器内时采用探针进行qrtPCR，并且检测从容器发出的荧光的水平，其中反应混合物中不存在小沟结合物(MGB)。在其它实施例中，公开一种在未事先应用提取技术的情况下直接定量核酸的方法，所述方法包括将固体载体沉积到反应容器中，当固体载体在反应容器内时采用无MGB的探针进行qrtPCR，并且检测从容器发出的荧光的水平。在一些实施例中，探针是不具有MGB的5′-核酸外切酶探针。在其它实施例中，所述方法包括提供不具有MGB的5′-核酸外切酶探针。在一些实施例中，按5′到3′顺序，所述方法的探针包括靶结合区和包括连接子的尾部以及模板结合区，其中靶结合区与探针的延伸产物互补，并且其中反应容器中不存在MGB。在其它实施例中，所述方法包括一种探针，其中按5′到3′顺序，所述探针包括靶结合区和包括连接子的尾部以及模板结合区，其中靶结合区与探针的延伸产物互补，并且其中探针不具有MGB。在其它实施例中，所述方法包括提供一种探针，其中按5′到3′顺序，所述探针包括靶结合区和包括连接子的尾部以及模板结合区，其中靶结合区与探针的延伸产物互补，并且其中探针不具有MGB。在一些实施例中，固体载体是滤纸。在其它实施例中，所述方法包括提供固体载体。本文还公开一种套组，所述套组包括DNA聚合酶、具有5′信号传导部分和3′淬灭部分但不具有MGB的5′-核酸外切酶探针，其中所述探针不会形成稳定茎-环结构和引物对，其中引物对杂交并且侧接多于一种染色体上可见的靶序列。在一些实施例中，所述套组包括具有5′信号传导部分和3′淬灭部分但不具有MGB的5′-核酸外切酶。在其它实施例中，所述套组包括具有5′淬灭部分和3′信号传导部分不具有MGB的5′-核酸外切酶探针。附图说明图1，1A-1D显示纸穿孔对使用Duo定量实时PCR检定的荧光检测的影响。当纸存在于反应容器中时，在除ROXTM染料外所有测试染料的情况下见证到背景荧光增加。背景荧光增加似乎与纸穿孔大小相关。图1A.-无穿孔，图1B.-0.5mm直径，图1C.-1.0mm直径，图1D.-2.0mm直径。图2，2A-2D显示纸穿孔对使用Trio定量实时PCR检定的荧光检测的影响。当纸存在于反应中时，在FAMTM和染料中而未在以及MUSTANGPURPLETM染料中见证到背景荧光增加，并且明显与大小相关。图2A.-无穿孔，图2B.-0.5mm直径，图2C.-1.0mm直径，图2D.-2.0mm直径。图3，3A和3B显示纸穿孔对在与小沟结合物(MGB)缀合或不缀合的探针的情况下的背景荧光的影响。图3A-Duo反应缓冲液。图3B-Trio反应缓冲液。相对于用相同荧光染料标记但无缀合MGB的探针，与MGB缀合的探针显示在0.5mm直径纸穿孔存在下的增加的背景荧光。图4，4A-4D显示在反应中存在或不存在纸穿孔(0.5mm直径、1mm直径以及2mm直径)的情况下利用1.0ng人类雄性基因组DNA的qrtPCR检定的结果。当探针未缀合到MGB时，甚至当纸穿孔存在于反应中时，背景荧光也是可忽略的。图4A-与MGB、Y染色体靶标缀合的探针；图4B-与MGB、常染色体靶标缀合的探针；图4C-不具有缀合MGB、Y染色体靶标的探针；图4D-不具有缀合MGB、常染色体靶标的探针。图5，5A和5B显示减少的背景荧光与探针类型无关。利用QuantiplexHYresqrtPCR检定分析2.5ng人类雄性基因组DNA。QuantiplexHYres利用用于靶标检测的探针。在具有或不具有纸穿孔(0.5mm直径、1mm直径以及2mm直径)的情况下，同样不具有缀合MGB的这些探针展示极少的背景荧光。图5A-不具有缀合MGB、Y染色体靶标的探针；图5B-不具有缀合MGB、常染色体靶标的探针。具体实施方式定量实时聚合酶链反应(qrtPCR)也称为定量聚合酶链反应(qPCR)，其是一种基于PCR的方法，其允许在热循环过程期间对靶核酸分子进行定量。qrtPCR的标准方法涉及使核酸悬浮在液体中，将这一含有DNA的液体与反应混合物组合，并且进行qrtPCR检定。在这一方法的最近描述的替代方案中，将具有嵌入核酸的固体载体与反应混合物组合，并且当存在固体载体时，进行qrtPCR检定。这一替代方法称为直接定量。“直接定量”一般指一种其中当如滤纸的固体载体存在于反应容器中时进行qrtPCR的方法。主题驱使直接定量是进行qrtPCR检定所必要的操控的次数或复杂度的最小化。因此，直接定量包括其中在沉积在反应容器中之前不处理固体载体的情况。对于qrtPCR，处理包括应用提取方法、缓冲液或洗涤，例如利用如水的溶剂的洗涤，之后将固体载体沉积在反应容器中。提取方法包括提取、应用苯酚/氯仿、应用经二氧化硅涂布的珠粒、应用离子交换膜以及应用具有离子表面的磁珠。包括直接定量的工作流的一个实例将是将样本，例如血液或口腔样品施加到滤纸上，干燥滤纸上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，其包含在反应容器中组合荧光标记探针和纸，当固体载体在所述反应容器中时进行定量实时聚合酶链反应(qrtPCR)并且检测在热循环期间从所述反应容器发出的荧光的水平，其中所述探针不与小沟结合物缀合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.30 US 14/3189251.一种方法，其包含在反应容器中组合荧光标记探针和纸，当固体载体在所述反应容器中时进行定量实时聚合酶链反应(qrtPCR)并且检测在热循环期间从所述反应容器发出的荧光的水平，其中所述探针不与小沟结合物缀合。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针是5′-核酸外切酶探针。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针是自身互补的。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述探针形成茎-环结构。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针是人类靶序列的反向互补序列。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述探针是人类常染色体靶序列的反向互补序列。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述探针与人类性染色体靶序列互补。8.根据权利要求7所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：JY刘，
申请(专利权)人：生命科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US