一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，包括如下步骤：1)提取不同组织的基因组DNA，稀释DNA样本浓度至5ng/ul，取各组织样本5ul合并混合后制成全基因组DNA模板；2)进行第一次实时定量PCR检测，检测端粒重复序列的端粒引物；3)进行第二次实时定量PCR检测，转录RNase P酶的单拷贝参照RNase P基因；4)计算相对端粒长度T/S。本发明专利技术的一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法具有的有益效果有：对样本和基因组DNA浓度要求不高，实验操作流程简单可行，结果可信度高，适用于科研和临床的推广使用，对于衰老、癌症和疾病的预防有重要作用。

Method for detecting telomere length of white blood cell based on qPCR method

The invention discloses a method for detecting leukocyte telomere length based on the qPCR method, which comprises the following steps: 1) extracting genomic DNA of different tissues, DNA diluted sample concentration to 5ng/ul, the 5ul combined with tissue samples made from mixture of whole genome DNA template; 2) for the first time quantitative real-time PCR detection, the detection of telomeric primers the telomeric repeat sequence; 3) second real time quantitative PCR detection of P enzyme, transcription of RNase single copy reference gene RNase P; 4) to calculate the relative telomere length of T/S. One of the invention has the beneficial effect of detection of leukocyte telomere length based on the qPCR method are: low requirement of samples and genomic DNA concentration, experimental operation is simple and feasible, reliable, widely used for scientific research and clinical practice, plays an important role in the prevention of disease, aging and cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法
本专利技术涉及分子遗传学领域，特别涉及一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法。
技术介绍
端粒(Telomeres)位于染色体的末端是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，长约5-15kb，由一串5’-3’方向的“TTAGGG”短片段重复序列和与之结合的蛋白组成，产生一个称为端粒体的特殊结构来保护染色体的稳定性，防止其末端发生融合和降解。它除了提供非转录DNA的缓冲物外，还能保护染色体末端免于融合和退化，在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长及寿命方面具有重要作用，并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。人端粒蛋白包括端粒结合蛋白与端粒相关蛋白，端粒结合蛋白包括TRF1、TRF2、hPOT1；端粒相关蛋白包括TIN2、TERT、Ku70、TPP1、RAP1、TANK1、TANK2、Pinx1、hRap1等。电镜观察发现，正常端粒在染色体末端形成一个稳定的T环(T-loop)结构，3’的DNA单链回转伸入DNA双链使部分双链解螺旋，与互补链配对结合后形成一个稳定的G4联体结构，这样的结构使得染色体的末端被包裹保护起来而防止降解和末端融合。随着细胞有丝分裂中染色体的周期性复制，端粒长度会逐渐缩短，环境因素如吸烟、氧化应激、饮食和肥胖都会加速端粒的缩短，从而影响染色体的稳定性。研究发现，端粒长度随年龄增大而逐渐缩短，青年时期的端粒长度耗损较快，处于一个平台期，在30-50岁、50-80岁这两个年龄段的端粒长度耗损变慢，端粒长度变短。端粒长度也存在性别差异，女性端粒长度要长于男性，并且随着后天雌激素影响，女性的端粒损耗比男性缓慢，但是女性在绝经之后的端粒耗损相较之前变快。大量研究表明，缩短的端粒与多种肿瘤，如前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌的发病风险以及死亡率有关，也与年龄相关性疾病和代谢疾病有所关联，如阿尔兹海默综合症、心梗、II型糖尿病、血管性痴呆、动脉粥样硬化和早衰综合征等。因此，端粒长度被认为是一种恒量人体机能的重要指标，建立一种通用有效的端粒长度测定方法对预防人体衰老和肿瘤等方便具有重要意义。科学家们从上世纪80年代就开始研究端粒长度的测定，并陆续建立了一系列检测端粒长度的方法，如FISH、SouthernBlot、Flow-FISH等，在这些方法中SouthernBlot比较直观，但要求的基因组较大(＞1ug)，同时其操作比较繁琐，耗时长。而利用FISH平台的一系列检测方法尽管快速便捷，但对样品的要求较高。不利于技术的推广应用。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，采用定量聚合酶链式反应(q-PCR)进行高通量的白细胞端粒长度(LTL)的检测，该方法对样本和基因组DNA浓度要求不高，实验操作流程简单可行，结果可信度高，适用于科研和临床的推广使用，对于衰老、癌症和疾病的预防有重要作用。本专利技术的一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，包括如下步骤：1)提取不同组织的基因组DNA，稀释DNA样本浓度至5ng/ul，取各组织样本5ul合并混合后制成全基因组DNA模板；2)进行第一次实时定量PCR检测，检测端粒重复序列的端粒引物为：SEQIDNO.1：CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT；SEQIDNO.2：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT；3)进行第二次实时定量PCR检测，转录RNaseP酶的单拷贝参照RNaseP基因；4)计算相对端粒长度T/S。进一步的，所述步骤1)的基因组DNA提取自血液、组织、唾液、精子或卵子的组织细胞。进一步的，所述步骤1)的提取方法包括酚/氯仿法、自动提取仪提取法或过柱离心试剂盒法。进一步的，所述步骤2)的第一次实时定量PCR检测和步骤3)的第二次实时定量PCR检测采用的染料均为SYBRGreenI。进一步的，所述步骤2)的第一次实时定量PCR检测和步骤3)的第二次实时定量PCR检测均为检测样本设置三个平行孔，并设置模板DNA的五个梯度浓度，比例为1、0.5、0.25、1.25、0.625，每个梯度设置三个平行孔，制作标准曲线。进一步的，所述步骤2)的端粒重复序列检测的PCR反应体系为一定配比的SuperRealPremixPlus，SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，DNA混合物；总反应体积为10ul；反应条件为：98℃，10min一个循环；95℃30s，60℃1min，共45个循环。进一步的，所述步骤3)的转录RNaseP酶的单拷贝参照RNaseP基因的PCR反应体系为一定配比的TaqmanExpressionMasterMix，RNaseP，DNA混合物，总反应体积为10ul；反应条件为：98℃，10min一个循环；95℃30s，60℃1min，共45个循环。本专利技术提供了一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，提供了检测端粒长度的引物和单基因拷贝参照。端粒重复序列拷贝数(Telomererepeatcopynumber，T)与单拷贝基因拷贝数(Single-genecopynumber，S)的比值(T/Sratio)和端粒长度成正比关系，本专利技术的相对平均端粒长度通过计算T/S的比例得到。计算公式为：LTL＝meanQuantity(LTL组)/meanQuantity(RNaseP组)。本专利技术一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法具有的有益效果有：对样本和基因组DNA浓度要求不高，实验操作流程简单可行，结果可信度高，适用于科研和临床的推广使用，对于衰老、癌症和疾病的预防有重要作用。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1本实施例的一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，包括如下步骤：1)提取不同组织的基因组DNA，稀释DNA样本浓度至5ng/ul，取各组织样本5ul合并混合后制成全基因组DNA模板；提取全基因组DNA：基因组DNA来自血液、组织、唾液、精子或卵子，采用酚/氯仿法提取全基因组DNA的具体步骤如下：(1)将冻存的抗凝血在室温解冻、混匀；(2)取200ul新鲜血液放入1.5ml离心管中；(3)加入200ul细胞裂解液，30ulProteinaseK，vortex15s混匀，55℃中水浴10min；(4)加入等体积苯酚，约500ul，vortex15s，12000rpm离心5min；(5)取上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇，约500ul，vortex15s，12000rpm离心5min；(6)取上清，加入等体积氯仿，约500ul，vortex15s，12000rpm离心5min；(7)取上清，加入2倍体积的无水乙醇，约800ul，vortex15s，12000rpm离心8min；(8)去上清，加入1ml75％乙醇，悬浮沉淀，12000rpm离心5min；(9)去上清，放置10min晾干；(10)加入100ulddH2O，室温放置5m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提取不同组织的基因组DNA，稀释DNA样本浓度至5ng/ul，取各组织样本5ul合并混合后制成全基因组DNA模板；2)进行第一次实时定量PCR检测，检测端粒重复序列的端粒引物为：SEQ ID NO.1：CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT；SEQ ID NO.2：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT；3)进行第二次实时定量PCR检测，转录RNase P酶的单拷贝参照RNase P基因；4)计算相对端粒长度T/S。

【技术特征摘要】
1.一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提取不同组织的基因组DNA，稀释DNA样本浓度至5ng/ul，取各组织样本5ul合并混合后制成全基因组DNA模板；2)进行第一次实时定量PCR检测，检测端粒重复序列的端粒引物为：SEQIDNO.1：CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT；SEQIDNO.2：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT；3)进行第二次实时定量PCR检测，转录RNaseP酶的单拷贝参照RNaseP基因；4)计算相对端粒长度T/S。2.根据权利要求1所述的一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，其特征在于：所述步骤1)的基因组DNA提取自血液、组织、唾液、精子或卵子的组织细胞。3.根据权利要求1所述的一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，其特征在于：所述步骤1)的提取方法包括酚/氯仿法、自动提取仪提取法或过柱离心试剂盒法。4.根据权利要求1所述的一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，其特征在于：所述步骤2)的第一次实时定量PCR检测和步骤3)的第二次实时定量PCR检测采...

【专利技术属性】
技术研发人员：余岚，
申请(专利权)人：浙江指针基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33