单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法技术

本发明专利技术公开了一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，采用累代单蛾区饲养、标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾进行PCR扩增和后期与常规品种杂交检测相结合来进行单拷贝转基因家蚕纯合品系的筛选。该法操作技术要求低，缩短了获得基因型纯合的转基因家蚕所需的时间，所得纯合品系后代的转基因表达率均在98％以上。应用本发明专利技术进行转羊毛KAP5.4基因家蚕纯合品系的筛选和培育，在3代内就能筛选出所需的纯合系，大大缩短了育种周期。因此，本发明专利技术可高效筛选获得单拷贝转基因家蚕纯合品系，为转基因家蚕品种的培育提供重要的技术支撑，若广泛应用于转基因家蚕品种培育研究可为培育综合经济性状优良的转基因家蚕品种奠定坚实的基础。

Homozygous method for single copy transgenic silkworm lines

The invention discloses a method for homozygous single copy transgenic silkworm strain, using the single generation interbatch breeding, marker gene screening, male moth, female moth testcrossing PCR amplification and post hybridization combined with conventional varieties of single copy transgenic silkworm homozygous strains screening. The method has low technical requirement and shortens the time required for obtaining homozygous transgenic silkworm. The transgenic expression rate of the homozygous line progeny is above 98%. The invention can be used for the screening and cultivation of the pure silkworm homozygous line of transgenic sheep KAP5.4 gene, and the required homozygous line can be screened out within 3 generations, thus greatly shortening the breeding cycle. Therefore, the invention can efficiently screened single copy transgenic silkworm homozygous strains, provide important technical support for the cultivation of transgenic silkworm varieties, if widely used in transgenic silkworm breeding for research on the basis of cultivating comprehensive economic characters of transgenic silkworm varieties lay a solid.

【技术实现步骤摘要】
单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法
本专利技术属于家蚕品种选育技术研究领域，尤其涉及一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法。
技术介绍
家蚕丝作为纺织材料虽然吸湿性好、易于加工、光泽柔和、舒适性佳，但也存在易生折皱、易变黄、易褪色等缺陷，这些缺陷严重制约了丝织产品品质的提升和附加值的提高。如果能有效地克服蚕丝这些固有的缺点，将会大大改善蚕丝的品质，推动丝绸织物在更高端、更广泛方面的应用。羊毛角蛋白是毛囊中表达最丰富的蛋白，并且在很大程度上决定了羊毛纤维的特性。研究表明，羊毛中角蛋白相关蛋白(keratin-associatedproteins，KAP)含量越丰富，羊毛的光泽就越好；该蛋白的数量与含量是决定羊毛品质的一个重要因素。2013年，西南大学赵爱春教授研究小组将羊毛KAP5.4基因成功转入家蚕基因组，该家蚕品种后部丝腺中表达了含有羊毛KAP蛋白的丝素蛋白，融合蛋白分泌到丝腺形成了含羊毛KAP蛋白的复合蚕丝，在蚕丝的改性方面做了重要的创新研究。申请人与西南大学合作进行该转羊毛KAP5.4基因家蚕的后期开发与利用。通过分析，外源转入的KAP5.4基因位于5号染色体。后续杂交等遗传分析也表明KAP5.4基因在该家蚕品系中是单基因遗传(即外源基因为单拷贝插入)，且只位于一条染色体上，KAP5.4基因的基因型为+-。另外，在转羊毛KAP5.4基因家蚕品种的后期培育中，为了提高综合经济性状，通常会结合杂交、回交等常规品种培育方式进行，这都会使外源转入的KAP5.4基因的基因型为+-，即杂合子，均需要获得纯合品系，以保证后代性状不发生分离。获得转基因生物纯合体(或纯合系)的方法多种多样，这主要根据前期转基因方法的不同而确定，主要有通过筛选标记筛选获得、设计特异PCR引物进行扩增筛选获得等。目前，国内未见关于能够高效筛选出转基因家蚕纯合品系的相关研究报道。使用上述方法进行转基因家蚕纯合品系的筛选与培育存在以下一些问题：(1)其他物种的转基因纯合系筛选方法不能完全适用于转基因家蚕纯合子筛选；(2)技术要求高，费时、费力又需要消耗大量资金。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，该法可高效筛选获得单拷贝转基因家蚕纯合品系，为培育综合经济性状优良的转基因家蚕品种奠定坚实的基础。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，采用累代单蛾区饲养、标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾进行PCR扩增和后期与常规品种杂交检测相结合来进行单拷贝转基因家蚕纯合品系的筛选。上述单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，按以下步骤操作进行：<1>使用非转基因蚕品种与单拷贝转基因家蚕阳性个体杂交，获得杂交F1代；<2>浸酸、催青F1代蚕卵至转青，挑选转入标记基因有表达的蛾区进行饲养；<3>饲养步骤<2>挑选出的F1代蛾区至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰不表达所转入基因的个体，挑选出目的基因有表达的个体饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得杂交F2代；<4>浸酸、催青杂交F2代蚕卵至转青，挑选转入标记基因有表达的蛾圈进行饲养，淘汰转入标记基因不表达的蛾圈；<5>饲养步骤<3>挑选出的F2代蛾圈至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰不表达所转入基因的个体，挑选出目的基因有表达的个体饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得自交F3代；自交结束后，对应的雄蛾再与常规非转基因品种雌蛾重交获得测交系，命名为F3代测交，测交系与自交系的各个蛾圈的蚕卵均一一对应编号；自交对应雌蛾产完卵以后也一一编号，每个雌蛾用剪刀一分为二，一半装入离心管放-20℃冻存，另一半送检毒室进行常规检疫；<6>浸酸、催青自交F3代和对应的测交系蚕卵至转青，通过筛选标记筛选，检测雄蛾的纯合性；自交和对应测交系标记基因表达率均为100％的蛾圈所对应的父本是纯合子，保留下该自交蛾圈卵，淘汰任何标记基因表达率不为100％的蛾圈；<7>选取步骤<6>中保留蛾圈所对应的母蛾编号，取出步骤<5>中对应编号冻存的离心管，提取其中母蛾的基因组DNA，然后利用特异引物进行PCR扩增，根据扩增结果保留对应编号的卵；<8>保留根据步骤<6>和<7>筛选出父本和母本均为纯合子所产下的蛾圈，饲养继代，筛选出的自交F3代即为该单拷贝转基因家蚕纯合品系。步骤<7>中的特异性引物是根据外源转入基因在染色体上插入位点上下游的基因组序列以及转基因结构序列设计的PCR引物F、R和LR。转基因家蚕为转羊毛KAP5.4基因家蚕。步骤<7>中的特异引物包括KAP5.4基因鉴定引物和piggyBac转座子结合引物，它们分别具有以下碱基序列：KAP5.4基因鉴定引物：F：5’-CTGTAGGAGTATCAAGAACGGAGATG-3’，R：5’-GACAGACAGATATAGGGACAGAGAAAGC-3’；piggyBac转座子结合引物：LR：5’-CAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGC-3’。针对目前使用筛选标记筛选转基因家蚕纯合子周期长、不够准确等缺点，以及使用特异PCR引物进行检测筛选技术要求高、工作量大而集中、试剂耗材等费用高、假阳性检测结果导致筛选不正确等不足，专利技术人建立了一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，采用累代单蛾区饲养、标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾进行PCR扩增和后期与常规品种杂交检测相结合来进行单拷贝转基因家蚕纯合品系的筛选。该法操作技术要求低，缩短了获得基因型纯合的转基因家蚕所需的时间(仅需3代即可筛选出纯合子、4代可准确无误的确定出转基因纯合品系)，所得纯合品系后代的转基因表达率均在98％以上(理论值为100％，但因为一些环境等因素会造成基因沉默等不表达的情况)。应用本专利技术进行转羊毛KAP5.4基因家蚕纯合品系的筛选和培育，在3代内就能筛选出所需的纯合系，快速、高效、技术难度系数低，大大缩短了育种周期。因此，本专利技术可高效筛选获得单拷贝转基因家蚕纯合品系，为转基因家蚕品种的培育提供重要的技术支撑；若广泛应用于转基因家蚕品种培育研究，可为培育综合经济性状优良的转基因家蚕品种奠定坚实的基础。与现有技术相比，本专利技术的突出优点在于：<1>若仅使用标记基因筛选，则只看得到表现型，难以排除杂合子，使自交后代常常分离出阴性个体，难以选育出稳定的转基因家蚕品种。而本专利技术采用标记基因筛选再结合测交测试结果筛选，将表现型与基因型有机结合，可大幅提高转基因纯合系筛选的效率。<2>许多筛选转基因纯合系的方法主要利用特异引物对所有亲本进行PCR检测，技术要求高、工作量大。然而，家蚕所产的卵进行即时浸酸后，便开始发育，大约8天就孵化，如果仅利用分子检测方法进行转基因家蚕纯合系筛选，8天时间难以完成所有亲本检测；如果将所产的卵进行冷藏，待分子检测的结果出来后再进行下一代的筛选，会大大延长筛选周期。而本专利技术利用简单的测交测试雄性亲本的基因型，有效排除了♀(+/+)×♂(+/-)和♀(+/-)×♂(+/-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，其特征在于采用累代单蛾区饲养、标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾进行PCR扩增和后期与常规品种杂交检测相结合来进行单拷贝转基因家蚕纯合品系的筛选。

【技术特征摘要】
1.一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，其特征在于采用累代单蛾区饲养、标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾进行PCR扩增和后期与常规品种杂交检测相结合来进行单拷贝转基因家蚕纯合品系的筛选。2.根据权利要求1所述的单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，其特征在于按以下步骤操作进行：<1>使用非转基因蚕品种与单拷贝转基因家蚕阳性个体杂交，获得杂交F1代；<2>浸酸、催青F1代蚕卵至转青，挑选转入标记基因有表达的蛾区进行饲养；<3>饲养步骤<2>挑选出的F1代蛾区至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰不表达所转入基因的个体，挑选出目的基因有表达的个体饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得杂交F2代；<4>浸酸、催青杂交F2代蚕卵至转青，挑选转入标记基因有表达的蛾圈进行饲养，淘汰转入标记基因不表达的蛾圈；<5>饲养步骤<3>挑选出的F2代蛾圈至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰不表达所转入基因的个体，挑选出目的基因有表达的个体饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得自交F3代；自交结束后，对应的雄蛾再与常规非转基因品种雌蛾重交获得测交系，命名为F3代测交，测交系与自交系的各个蛾圈的蚕卵均一一对应编号；自交对应雌蛾产完卵以后也一一编号，每个雌蛾用剪刀一分为二，一半装入离心管放-20℃冻存，另一半送检毒室进行常规检疫；<6>浸酸、催青自交F3代和对应的测交系蚕卵至转青，通过筛选标记筛选...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雨丽，赵爱春，张桂征，龙定沛，闭立辉，向仲怀，韦伟，韦博尤，黄文功，鲁成，苏红梅，黄玲莉，蒙艺英，
申请(专利权)人：广西壮族自治区蚕业技术推广总站，西南大学，
类型：发明
国别省市：广西,45