RNA扩增方法技术

提供了检测并扩增短RNA的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RNA扩增方法相关申请的交叉引用本申请要求2014年8月19日提交的美国临时专利申请号62/039,094的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。专利技术背景细胞中出现多种类型的非编码短RNA。这类RNA的示例包括但不限于miRNA、snoRNA、piRNA、或lncRNA。
技术实现思路
提供了扩增短RNA分子的方法。在一些实施方式中，该方法包括：获得包含短RNA靶分子的RNA样品；使包含短RNA靶分子的样品和至少一种含RNA的模板分子与逆转录酶接触，其中该短RNA靶分子退火至含RNA的模板分子并且该逆转录酶通过延伸退火的短RNA分子来逆转录该含RNA的模板分子，以形成包含退火至模板RNA分子的短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸的双链体；使该双链体接触RNA酶H活性，从而在该双链体中的退火至短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸的脱氧核糖核苷酸的含RNA的模板分子的部分中切下核糖核苷酸；通过用逆转录酶延伸退火至单链短RNA靶分子/cDNA杂合体的第一寡核苷酸引物，来逆转录短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸的至少短RNA靶分子部分，以形成包含与短RNA靶分子互补的序列的DNA分子；和，用DNA聚合酶扩增包含与短RNA靶分子互补的序列的DNA分子，从而扩增该短RNA序列。在一些实施方式中，从外源性来源添加第一寡核苷酸引物。在一些实施方式中，短RNA是miRNA、snoRNA、piRNA、或lncRNA。在一些实施方式中，短RNA长度为30个或更少核苷酸。在一些实施方式中，含RNA的模板分子是来自样品的天然产生的RNA分子。在一些实施方式中，第一寡核苷酸引物具有12-16个核苷酸并且包含不与单链短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸互补的5’部分和与单链短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸互补的3’部分。在一些实施方式中，第一寡核苷酸引物包含与单链短RNA靶分子/cDNA融合多核苷酸互补的至少6个核苷酸的长度。在一些实施方式中，第一寡核苷酸引物的3’部分长度为6-10个核苷酸。在一些实施方式中，第一寡核苷酸引物的5’部分长度为3-6个核苷酸。在一些实施方式中，DNA聚合酶具有6-10个核苷酸的DNA足迹。在一些实施方式中，DNA聚合酶连接至具有4-6个核苷酸的DNA足迹的DNA-结合结构域。在一些实施方式中，含RNA的模板分子对于样品是异源的。在一些实施方式中，含RNA的模板分子包含(i)与短RNA靶标互补并且含RNA的3’部分和(ii)当含RNA的模板分子退火至短RNA靶分子时形成5’突出端的5’部分。在一些实施方式中，除了与3’部分连接的5’部分的1-2个核糖核苷酸部分以外，5’部分是DNA。在一些实施方式中，第一引物是通过RNA酶H活性释放的5’DNA部分。在一些实施方式中，3’部分和5’部分是RNA。在一些实施方式中，样品的接触包括使该样品与短RNA靶标和具有5’部分和3’部分的多个含RNA的模板分子接触，其中所述3’部分包含至少4个核苷酸的简并序列，使得该多个模板分子包含具有不同3’部分和相同5’部分的多样的含RNA的分子。在一些实施方式中，向双链体添加RNA酶H酶，从而使该双链体与RNA酶H活性接触。在一些实施方式中，RNA酶H酶来自逆转录酶。在一些实施方式中，扩增包括生成扩增子，并且该方法还包括对该扩增子进行核苷酸测序。在一些实施方式中，该方法还包括对样品中的短RNA靶分子的量进行定量。还提供了扩增长度少于30个核苷酸的非-聚A加尾RNA的方法。在一些实施方式中，该方法包括：通过延伸具有与所述RNA互补的至少6个连续核苷酸的第一引物逆转录该RNA，以产生除引物序列以外包含至少10个核苷酸的长度的序列的第一链cDNA，其与该RNA互补，用DNA聚合酶-DNA结合结构域融合物来扩增第一链cDNA以延伸第二引物，其中该DNA聚合酶具有6-10个碱基对的足迹并且该DNA结合结构域具有3-5个碱基对的足迹，并且其中第二引物包含与第一链cDNA的3’区互补的连续碱基对，以产生双链cDNA。在一些实施方式中，第一引物包含不与RNA互补的5’部分。在一些实施方式中，第二引物包含与第一链cDNA的3’区互补的12-16个连续碱基对。在一些实施方式中，该聚合酶是TaqStoffel片段或其类似物。在一些实施方式中，DNA结合结构域是Sso7dDNA结合结构域。在一些实施方式中，RNA是miRNA、snoRNA、piRNA、或lncRNA。在一些实施方式中，第一引物具有与RNA互补的6-12个连续核苷酸。在一些实施方式中，5’部分长度为3-6个核苷酸。在一些实施方式中，扩增包括生成扩增子，并且该方法还包括对该扩增子进行核苷酸测序。在一些实施方式中，该方法还包括对样品中的非-聚A加尾RNA的量进行定量。还提供了从非-聚A加尾RNA生成cDNA的方法。在一些实施方式中，该方法包括：用末端转移酶向靶非-聚A加尾RNA的3’末端添加随机聚-W(A/T)或聚-S(G/C)核苷酸序列以形成在该分子的3’末端处包含简并核苷酸序列的RNA分子；使包含随机聚-W或聚-S核苷酸序列的RNA分子经历一定条件使得该包含随机聚-W或聚-S核苷酸序列的RNA分子退火以形成通过随机聚-W或聚-S核苷酸序列退火至彼此的第一和第二RNA分子的双链体；并且用DNA聚合酶延伸双链体中分子的3’末端以形成(i)与双链体的第一RNA分子互补的第一cDNA和(ii)与双链体的第二RNA分子互补的第二cDNA，其中该第一和第二cDNA还包含5’序列，其是随机聚-W或聚-S核苷酸序列的互补物。在一些实施方式中，RNA是miRNA、snoRNA、piRNA、或lncRNA。在一些实施方式中，该方法还包括用RNA酶H活性消化RNA分子。在一些实施方式中，该方法还包括用退火至简并序列的互补物的引物扩增第一或第二cDNA。在一些实施方式中，添加还包括使非-聚A加尾RNA接触聚A聚合酶(例如，酵母聚A聚合酶)。在一些实施方式中，扩增包括生成扩增子，并且该方法还包括对该扩增子进行核苷酸测序。在一些实施方式中，该方法还包括对样品中的非-加尾RNA的量进行定量。本文他处描述本专利技术的其他方面。附图的简要说明图1显示了使用含RNA的模板检测靶短RNA的方法的步骤。虽然该图将靶RNA称为“miRNA”，应理解可也检测其他类型的RNA。图2显示了使用含RNA的模板检测靶短RNA的方法的步骤，该模板是合成RNA寡核苷酸。虽然该图将靶RNA称为“miRNA”，应理解可也检测其他类型的RNA。图3显示了使用含RNA的模板检测靶短RNA的方法的步骤，该模板是RNA/DNA寡核苷酸。虽然该图将靶RNA称为“miRNA”，应理解可也检测其他类型的RNA。图4显示了将“第一”引物杂交至靶RNA/cDNA杂合体的一些不同可能的实施方式。如该图的部分A所示，第一引物的部分可退火至靶RNA序列的3’部分和cDNA序列的5’部分。或者，该图的部分B显示一个实施方式，其中第一引物仅退火至cDNA序列。该图的部分B的实施方式将最常应用在使用合成模板时，因为该合成模板的序列将是已知的。然而，应理解部分B实施方式也可用于使用内源性模板RNA的情况中，并且模板RNA序列是已知的。图5A和B显示了逆转录并且然后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增短RNA分子的方法，所述方法包括，获得包含短RNA靶分子的RNA样品；使包含所述短RNA靶分子的样品和至少一种含RNA的模板分子与逆转录酶接触，其中所述短RNA靶分子退火至所述含RNA的模板分子并且所述逆转录酶通过延伸退火的短RNA分子来逆转录所述含RNA的模板分子，以形成包含退火至模板RNA分子的短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸的双链体；使所述双链体接触RNA酶H活性，从而在该双链体中的退火至短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸的脱氧核糖核苷酸的含RNA的模板分子的部分中切下核糖核苷酸；通过用逆转录酶延伸退火至单链短RNA靶分子/cDNA杂交体的第一寡核苷酸引物，来逆转录短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸的至少短RNA靶分子部分，以形成包含与所述短RNA靶分子互补的序列的DNA分子；和用DNA聚合酶扩增包含与所述短RNA靶分子互补的序列的DNA分子，从而扩增所述短RNA序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.19 US 62/039,0941.一种扩增短RNA分子的方法，所述方法包括，获得包含短RNA靶分子的RNA样品；使包含所述短RNA靶分子的样品和至少一种含RNA的模板分子与逆转录酶接触，其中所述短RNA靶分子退火至所述含RNA的模板分子并且所述逆转录酶通过延伸退火的短RNA分子来逆转录所述含RNA的模板分子，以形成包含退火至模板RNA分子的短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸的双链体；使所述双链体接触RNA酶H活性，从而在该双链体中的退火至短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸的脱氧核糖核苷酸的含RNA的模板分子的部分中切下核糖核苷酸；通过用逆转录酶延伸退火至单链短RNA靶分子/cDNA杂交体的第一寡核苷酸引物，来逆转录短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸的至少短RNA靶分子部分，以形成包含与所述短RNA靶分子互补的序列的DNA分子；和用DNA聚合酶扩增包含与所述短RNA靶分子互补的序列的DNA分子，从而扩增所述短RNA序列。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，从外源性来源添加所述第一寡核苷酸引物。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述短RNA是miRNA、snoRNA、piRNA、或lncRNA。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，短RNA长度为30个或更少核苷酸。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含RNA的模板分子是来自样品的天然产生的RNA分子。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸引物具有12-16个核苷酸并且包含不与单链短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸互补的5’部分和与单链短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸互补的3’部分。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸引物包含与单链短RNA靶分子/cDNA融合多核苷酸互补的至少6个核苷酸的长度。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，第一寡核苷酸引物的3’部分长度为6-10个核苷酸。9.如权利要求6或8所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸引物的5’部分长度为3-6个核苷酸。10.如权利要求5-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶具有6-10个核苷酸的DNA足迹。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶连接至具有4-6个核苷酸的DNA足迹的DNA-结合结构域。12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含RNA的模板分子对于所述样品是异源的。13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述含RNA的模板分子包含(i)与短RNA靶标互补并且包含RNA的3’部分和(ii)当含RNA的模板分子退火至该短RNA靶分子时形成5’突出端的5’部分。14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，除了与3’部分连接的5’部分的1-2个核糖核苷酸部分以外，所述5’部分是DNA。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述第一引物是通过RNA酶H活性释放的5’DNA部分。16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述3’部分和5’部分是RNA。17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，样品的接触包括使所述样品与短RNA靶标和具有5’部分和3’部分的多个含RNA的模板分子接触，其中所述3’部分包含至少4个核苷酸的简并序列，使得所述多个模板分子包含具有不同3’部分和相同5’部分的多样的含RNA的分子。18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，向所述双链体添加RNA酶H酶，从...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑旻，龚小松，王焱，A·M·麦考伊，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US