5′RACE RNA接头序列及用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA 5′末端的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种用于5′RACE的高效RNA接头序列，所述接头序列如Seq ID No.1所示。本发明专利技术还提供含有所述接头序列的用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA 5′末端的试剂盒。本发明专利技术通过对市场上5′RACE的RNA接头序列进行优化，使其引物很大程度减少了二聚体和发夹结构的可能性，可以更高灵敏度、更高特异性的扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端序列，从而高效地验证miRNA靶基因的断裂位点，与市场上同类试剂盒产品相比，成本更低，灵敏性更高，准确性更强。

【技术实现步骤摘要】
5′RACERNA接头序列及用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端的试剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于5′RACE的高效RNA接头序列及用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端的试剂盒，所述RNA接头序列可以扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端序列，从而进行miRNA的靶基因验证。
技术介绍
cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends,RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法，是根据基因已知的部分序列扩增未知片段的最佳方法。RACE技术概括地说就是通过逆转录和PCR的有机结合，扩增基因未知片段的技术。利用基因编码区3’端的已知序列，获得5’端未知序列的技术称为5’-RACE，是目前扩增5’端未知基因完整编码序列的最常用技术。5’-RACE基本原理：首先获得包含目的基因mRNA的RNA样品，并利用基因特异的引物进行逆转录，获得目的基因相应的cDNA；在cDNA的3’末端(对应mRNA序列5’末端)加上特定的序列，通常将这段添加在cDNA上的特定序列称为接头(adaptor)，同时合成与adaptor序列相匹配的引物，称为锚定引物；然后利用基因已知序列设计基因特异性引物，与锚定引物配对进行PCR扩增，得到未知部分的片段；再将扩增得到的片段测序，即可获得目的基因未知部分的序列。目前按接头序列的添加方法可分为3大类：末端转移酶法(terminaldeoxynucleotidyltransferasemethod，TdT方法)、接头连接法(adaptorligation)和寡核苷酸帽法(oligocappingmethod)。寡核苷酸帽法又称RLM-RACE。真核生物mRNA具有一个3’尾巴和一个5’帽子结构，该技术正是利用5’端的帽子特性对全长分子进行富集和扩增，可以更精确的定位转录起始位点。目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa、Clontech和Ambion等厂家都有生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种更高灵敏度、更高特异性的扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA的5′末端的5′RACERNA接头序列。本专利技术的另一目的是提供含有上述5′RACERNA接头序列的用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端的试剂盒。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的用于5′RACE的高效RNA接头序列，所述RNA接头序列为：5'-GCGUGACCACUAGUCACGUCUGAGUUCGUCGCCAUUCCACAAA-3'(SeqIDNo.1)。本专利技术还提供含有上述接头序列的用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端的试剂盒。前述的试剂盒还包括用于巢式PCR的5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物，引物序列如下：5′RACE外侧引物：5'-ACTAGTCACGTCTGAGTTCG-3'(SeqIDNo.2)5′RACE内侧引物：5'-CGCGGATCCACGTCTGAGTTCGTCGCCATTCCAC-3'(SeqIDNo.3)前述的试剂盒还包括T4RNA连接酶、RNA连接酶缓冲液、RNase抑制剂、反转录酶M-MLV、M-MLV缓冲液、dNTPs、Random9mers、RNaseFreedH2O、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。本专利技术还提供利用5′RACE扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端序列的方法，包括以下步骤：1)根据目的基因已知的cDNA序列设计用于巢式PCR的上游外侧特异性引物GSP1和上游内侧特异性引物GSP2；2)用T4RNA连接酶将5′RACE接头连接到miRNA剪切后的靶mRNA上；3)以步骤4)的靶mRNA为模板，Random9mers为反转录引物，用反转录酶M-MLV进行反转录合成cDNA；4)以步骤5)的cDNA为模板，进行巢式PCR反应，用上游外侧特异性引物GSP1和5′RACE外侧引物进行第一轮PCR反应，再用上游内侧特异性引物GSP2和5′RACE内侧引物进行第二轮PCR反应；5)分析PCR产物。其中，步骤4)中所述5′RACE接头的序列如下：5'-GCGUGACCACUAGUCACGUCUGAGUUCGUCGCCAUUCCACAAA-3'(SeqIDNo.1)。步骤4)中所述5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物的序列分别如下：5′RACE外侧引物：5'-ACTAGTCACGTCTGAGTTCG-3'(SeqIDNo.2)5′RACE内侧引物：5'-CGCGGATCCACGTCTGAGTTCGTCGCCATTCCAC-3'(SeqIDNo.3)前述的方法，步骤1)中引物设计原则如下：①引物长度为20-28nt；②引物中GC含量为45％-55％，GC、AT分布均匀，避免局部富含GC或AT；③引物不形成二级结构，与5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物不形成复杂结构；④引物3′端的3-4个碱基不与配对引物形成互补序列。前述的方法，步骤2)的具体操作如下：a)配制反应液I：miRNA剪切后的靶mRNA5μl，15μM5′RACE接头1μl，RNaseFreedH2O4μl；b)反应液I于65℃保温5分钟后冰上放置2分钟，然后向反应液I中加入40U/μlRNase抑制剂1μl，5×RNA连接酶缓冲液8μl，40％PEG600020μl，40U/μlT4RNA连接酶1μl，即得反应液II：c)将反应液II于16℃反应1小时；d)向c)的反应液中加入20μlpH5.2的3MCH3COONa，140μl的RNaseFreedH2O后混匀；e)向d)的反应液中加入200μl体积比为25：24：1的苯酚/氯仿/异戊醇，混匀后13000g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中；f)向e)的反应液中加入200μl的氯仿，混匀后13000g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中；g)向f)的反应液中加入2μl的NACarrier后混匀；h)向g)的反应液中加入200μl的异丙醇，混匀后冰上冷却10分钟；i)13000g4℃离心20分钟，弃上清；加入500μl的70％冷乙醇漂洗，13000g4℃离心5分钟，弃上清后干燥；j)加入6μl的RNaseFreedH2O溶解沉淀，得到LigatedRNA。前述的方法，步骤3)的具体操作如下：k)配制反转录反应液：LigatedRNA6μl，50μMRandom9mers0.5μl，5×M-MLV缓冲液2μl，10mMdNTPs1μl，40U/μlRNase抑制剂0.25μl，200U/μl反转录酶M-MLV0.25μl；l)按如下条件进行反转录反应：30℃10分钟；42℃1小时；70℃15分钟。前述的方法，步骤4)的具体操作如下：m)配制第一轮PCR反应液：反转录反应液2-5μl，1×cDNA稀释缓冲液5-8μl，10×PCR反应缓冲液4μl，25mMMgCl23μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.25μl，10μM上游外侧特异性引物GSP12μl，10μM5′RACE外侧引物2μl，用dH2O补足至50μl；n)按如下条件进行第一轮P本文档来自技高网...

【技术保护点】
5′RACE的高效RNA接头序列，其特征在于，所述RNA接头序列为：5′‑GCGUGACCACUAGUCACGUCUGAGUUCGUCGCCAUUCCACAAA‑3′。

【技术特征摘要】
1.含有5′RACE高效RNA接头序列的用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括5′RACE的高效RNA接头序列以及用于巢式PCR的5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物；其中，所述RNA接头序列为：5'-GCGUGACCACUAGUCACGUCUGAGUUCGUCGCCAUUCCACAAA-3'；所述5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物的序列如下：5′RACE外侧引物：5'-ACTAGTCACGTCTGAGTTCG-3'5′RACE内侧引物：5'-CGCGGATCCACGTCTGAGTTCGTCGCCATTCCAC-3'。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括T4RNA连接酶、RNA连接酶缓冲液、RNase抑制剂、反转录酶M-MLV、M-MLV缓冲液、dNTPs、Random9mers、RNaseFreedH2O、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。3.利用5′RACE扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)根据目的基因已知的cDNA序列设计用于巢式PCR的上游外侧特异性引物GSP1和上游内侧特异性引物GSP2；2)用T4RNA连接酶将5′RACE接头连接到miRNA剪切后的靶mRNA上；3)以步骤2)的靶mRNA为模板，Random9mers为反转录引物，用反转录酶M-MLV进行反转录合成cDNA；4)以步骤3)的cDNA为模板，进行巢式PCR反应，用上游外侧特异性引物GSP1和5′RACE外侧引物进行第一轮PCR反应，再用上游内侧特异性引物GSP2和5′RACE内侧引物进行第二轮PCR反应；5)分析PCR产物；其中，步骤2)中所述5′RACE接头的序列如下：5'-GCGUGACCACUAGUCACGUCUGAGUUCGUCGCCAUUCCACAAA-3'；步骤4)中所述5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物的序列分别如下：5′RACE外侧引物：5'-ACTAGTCACGTCTGAGTTCG-3'5′RACE内侧引物：5'-CGCGGATCCACGTCTGAGTTCGTCGCCATTCCAC-3'。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中引物设计原则如下：①引物长度为20-28nt；②引物中GC含量为45％-55％，GC、AT分布均匀，避免局部富含GC或AT；③引物不形成二级结构，与5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物不形成复杂结构；④引物3′端的3-4个碱基不与配对引物形成互补序列。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)的具体操作如下：a)配制反应液I：miRNA剪切后的靶mRNA5μl，15μM5′RAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张冉，韦朝领，张骁，张菲，师聪，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34